体外胚胎生产技术是提高良种家畜繁殖效率的关键核心技术之一。然而,由于体内、外环境差异造成的卵母细胞成熟质量差、体外胚胎发育率低等问题严重制约了该技术的产业化应用。微流体技术是利用尺寸为几十到几百微米的微通道精确控制和操纵亚微米结构流体的科学与技术,由于其具有样品消耗少、分析速度快、高通量和高集成化等特点,正广泛应用于化学、医学、生命科学等领域。在家畜体外胚胎生产若干技术环节中,微流体技术显示出巨大的应用前景。本文综述了微流体技术在卵母细胞选择培养、精子分选、体外受精、体外胚胎培养以及配子和胚胎超低温冷冻保存中的应用进展,为提升家畜体外胚胎生产效率提供新思路。

哺乳动物早期胚胎发育过程中,受精卵经历了一系列表观遗传重编程事件,去除了雌雄原核的表观遗传记忆,从而建立了胚胎的全能性。然而,这些重编程事件的进行必须受到种属特异性的精确调控,而相关的调控机制仍需进一步研究。随着分子生物学技术的不断发展,特别是微量全基因组染色质分析技术的突破性进展,哺乳动物早期胚胎发育中的表观遗传重编程调控网络研究取得了重大进展。本文旨在介绍模式动物和多种家畜的表观遗传重编程机制的进展,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质开放性和染色质三维结构等方面的研究。

近年来,由于对肠道中菌群的研究不断深化,同时对肠道菌群和机体健康的关系也有了更加清晰的认识,发现肠道菌群对病毒的感染有着双重调节的作用。肠道菌群可以通过保护肠黏膜屏障以及直接与病毒结合进而中和病毒或者阻止病毒对细胞黏附的直接作用抑制病毒感染,或通过对机体免疫系统建立和发育产生影响的间接方式来抑制病毒的入侵以及分泌具有抗病毒作用的代谢产物来发挥抗病毒作用;此外,益生菌在疾病治疗中的作用也越来越突出,有望从益生菌入手解决当前治疗病毒性疾病的弊端。本文着重对近年来肠道菌群抵抗病毒感染的相关机制研究进展进行综述,并对此方向相关问题及进一步的相关研究进行展望。

猪链球菌(Streptococcus suis,S. suis)感染长期困扰我国养猪业的健康和可持续性发展,尤其耐药性菌株的出现阻断原本的链球菌病防治策略。针对近年来国内外S. suis的耐药性流行情况的总结,可以为防治S. suis感染提供有效措施。因此,作者首先总结近五年来在国内外多个地区规模化猪场S. suis感染情况(阳性率普遍>40%),其中我国各省市中流行范围最广的是血清2型菌株。随后,作者归纳了猪场中耐药性S. suis流行现状及其感染特点,发现规模化猪场中的耐药性S. suis集中出现在亚洲大陆以及欧洲且多数地区耐药性高达80%以上,以四环素类耐药菌株为主。而我国规模化猪场中耐药性S. suis主要以四环素类和大环内酯类耐药为主。此外,S. suis是人畜共患的病原,可以经呼吸道和血液造成全身感染。最后,针对S. suis菌株变异多的特点,作者提出了精准检测对于防控S. suis感染的重要性并总结了目前常用的快速检测手段。强调以疫苗接种为主的防控手段和联合用药及宿主导向的新型抗菌药物研发的防治措施,为后续S. suis的耐药性菌株感染的防治提供数据支撑。

副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum, Apg) 是鸡传染性鼻炎的病原菌,可以引起鸡鼻腔分泌黏液性物质、打喷嚏、眶下窦肿胀、面部水肿和结膜炎等临床症状,导致病鸡生长不良,产蛋率急剧下降,从而危害养禽生产。Apg的致病性受多种因素影响,包括荚膜、脂多糖等细胞壁结构成分和菌体分泌的功能性蛋白(如血凝素和金属蛋白酶等)。本文从生物被膜及组分、细菌分泌物、铁离子获取和利用等方面对Apg毒力因子的研究进展进行归纳和综述,以期为鸡传染性鼻炎的科学防治提供理论参考。

旨在探究提高杜洛克猪胴体性状基因组选择准确性的方法,为提高种猪胴体性状的基因组选择准确性提供理论基础。本研究以2 796头杜洛克公猪和3 149头杜长大商品猪的校正115 kg体重日龄(AGE115)、校正115 kg背膘厚(BF115)和校正115 kg眼肌面积(LEA115)为研究对象。构建加性动物模型和加显动物模型验证显性效应对杜洛克猪基因组选择准确性的影响;探究在参考群中对杜洛克猪与杜长大猪进行不同的组合对于杜洛克猪基因组选择准确性的影响。参考群分组如下:组1,杜洛克猪作为参考群;组2,杜长大猪作为参考群;组3,杜洛克和杜长大猪合并作为参考群。研究结果表明:加入显性效应后,AGE115基因组选择的准确性在组1、组2、组3中提高了2.84%~4.87%,杜洛克猪BF115和LEA115的基因组选择准确性在组1、组3中提高了1.37%~16.18%;组3相对于组1,在加性动物模型中BF115和LEA115的基因组选择准确性提高了6.19%~7.35%,在加显动物模型中BF115的基因组选择准确性提高了6.52%。综上,显性效应能够提升猪胴体性状的基因组选择准确性,合并杜洛克猪与杜长大猪作参考群能够提升猪部分胴体性状的基因组选择准确性,建议将合适的杂种猪群体纳入纯种猪选育的参考群。

旨在研究、构建文昌鸡母鸡体重和体组分重的生长模型,为文昌鸡的高效养殖提供科学依据。本研究选择体重接近的1日龄健康母雏300只,随机分为6个重复,常规饲养至119日龄。每周以重复为单位测定文昌鸡的体重,每个重复取2只鸡测定体组成。研究发现,随周龄增加,文昌鸡母鸡的体重、胴体重、羽毛重、体蛋白和体脂肪重等显著升高(P<0.001)。分别采用Gompertz、Von Bertalanffy、Logistic和Richards四种非线性函数拟合文昌鸡体重、体蛋白和体脂肪的生长曲线,根据回归模型的决定系数、均方误差、赤池信息准则和残差平方和,发现Gompertz模型的拟合度最高。利用Gompertz函数公式,建立了文昌鸡体重、胴体、羽毛、体蛋白和体脂肪等组分的生长模型,除羽毛水分重外,其他组分生长模型的决定系数接近或超过0.99,其中体重、体蛋白和体脂肪的成熟重分别为2 382 g、696.8 g和1 037.1 g,相对成熟速度分别为0.023 2、0.017 4和0.017 8。利用Gompertz模型可以预测文昌鸡不同日龄的体重和体组分重。这些模型及其微积分公式有助于文昌鸡的遗传选育和生产决策,同时也为今后预测文昌鸡母鸡每日能量和氨基酸需要量提供了基础。

旨在探究新浦东鸡群体的遗传多样性、亲缘关系及家系结构。本研究采用"京芯一号"SNP芯片对368只新浦东鸡全基因组范围内的SNPs进行检测,对新浦东鸡的遗传结构、亲缘关系和近交系数进行了分析,以期揭示个体之间的亲缘关系。结果共得到55 023个SNPs,通过Plink软件质控,剩余42 267个有效SNPs,其中78%的SNPs具有多态性;各位点平均有效等位基因数为1.552,PIC为0.237,MAF为0.226,Ho为0.355,H_E为0.353。新浦东鸡群体的平均IBS遗传距离为0.280 9,110只公鸡的平均IBS遗传距离为0.280 1。通过聚类分析(标准为亲缘关系系数大于等于0.1)构建新浦东鸡家系,110只公鸡被划分为32个家系。新浦东鸡个体ROH长度在0~350 Mb之间,其中,个体ROH长度在100~150 Mb内的个体数比例最大,基于ROH值计算的群体平均近交系数为0.155,近交程度较高。综上,本研究从基因组水平揭示了新浦东鸡的种群遗传结构和遗传多样性,可为后续的种群选育及开发利用工作提供参考。

旨在通过慢病毒包装SV40-LT基因并转导PMSCs以构建鸡骨骼肌卫星细胞系。本研究采集20~30枚15胚龄健康AA鸡的胸部组织,采用混合酶消化法分离培养PMSCs。将细胞随机分为两组,每组3个重复,处理组选择SV40-LT慢病毒转染48 h后,更换含1 μg·mL^-1的嘌呤霉素筛选培养基于处理组和对照组(病毒不转染)。待对照组细胞全部死亡,对处理组细胞进行不断传代培养,最终获得鸡骨骼肌卫星细胞系。免疫荧光试验分析鸡骨骼肌卫星细胞标志基因PAX7的表达;采用CCK-8和细胞周期分析检测细胞增殖特性;血清依赖性和软琼脂分析检测其恶性转化情况;构建诱导分化模型检测其诱导分化能力。结果表明,PMSCs中有92%细胞PAX7基因呈阳性,可用于后续研究。SV40-LT基因在鸡骨骼肌卫星细胞系(IMSCs P12)中的表达是原代鸡骨骼肌卫星细胞的15倍,且连续传代至12代后,IMSCs P12与PMSCs均呈纤维样状。IMSCs P12具有更高的增殖活性且没有发生恶性转化,随后,对IMSCs P12进行诱导分化,在其增殖至70%到诱导分化1 d这一阶段,IMSCs P12与PMSCs的PAX7基因表达下调,而MyoD和MyHC基因表达上调。结果提示,本研究通过转染SV40-LT基因成功培养了鸡骨骼肌卫星细胞系,其具有与原代鸡骨骼肌卫星细胞相似的特性。该细胞系的建立为研究家禽骨骼肌相关的功能基因提供了新的平台,也为SV40-LT基因在家禽细胞永生化的研究奠定了基础。

旨在利用全基因组关联分析(GWAS)方法挖掘影响肉鸡体重和肉品质性状的位点和功能基因,为快速型黄羽肉鸡的选育积累理论基础。本试验对象为393只立华麻黄终端父系公鸡,60日龄时进行称重并采集胸肌以测定肉品质性状。通过全基因组重测序获得个体遗传变异,使用PLINK、GEMMA和R软件对体重及肉品质性状进行GWAS分析。结果,共筛选到2个与体重、8个与肉品质性状显著关联的SNPs位点(P<1.15×10^-7);在潜在显著水平鉴定到52个与体重、296个与肉品质关联的位点(P<2.31×10^-6)。通过对这些关联的SNPs进行注释,共筛选到了99个与体重、27个与剪切力、28个与系水力、57个与pH、113个与肉色相关的候选基因。分析认为FSTL3、MBNL3、NPFF、PFKM、PRKG1、SLC13A5、MDFIC、FGD3、AQP1等基因可作为肉鸡体重和肉质性状的关键候选基因。以上研究结果为快速型黄羽肉鸡重要经济性状提供了重要的遗传变异位点和后续基因,为完善优质肉鸡分子选育方法、加快品种选育进展提供了关键的基础数据。

旨在克隆山羊GPR35基因序列,探究其表达特性并初步阐明该基因对山羊皮下前体脂肪细胞分化的影响以及可能的作用机制。本研究以1周岁的健康雄性(n=4)简州大耳羊为试验对象,利用RT-PCR技术(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)克隆山羊GPR35基因完整的蛋白质编码区(sequence coding for amino acids in protein, CDS)序列,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技术检测 GPR35 基因在山羊各组织及不同分化阶段皮下脂肪细胞中的表达情况;随后将GPR35 过表达载体(pEGFP-N1-GPR35)及其干扰序列(Si-GPR35)分别转染至山羊皮下前体脂肪细胞中并使用油酸诱导分化,通过油红O和Bodipy染色对其脂滴的变化进行形态学观察并对其甘油三酯含量变化进行检测,最后通过qRT-PCR技术来检测脂肪细胞分化、甘油三酯合成和分解相关标志基因的表达量变化(所有样本均设置3个生物学样本重复和3个技术重复)。结果表明,克隆获得的山羊GPR35基因序列全长为1 167 bp,开放阅读框长906 bp,共编码301个氨基酸残基。GPR35基因在山羊背最长肌中的表达量显著高于其它肌肉组织(P＜0.01);在皮下脂肪中的表达量显著高于其它脂肪组织(P＜0.01);在脾脏中显著高于山羊的其它内脏组织(P＜0.01),此外该基因在诱导分化120 h 后的皮下脂肪细胞中表达量最高(P＜0.01)。过表达和干扰GPR35后分别抑制和促进皮下脂肪细胞中的脂滴含量和聚集程度,甘油三酯相对含量分别显著下降和上升;过表达该基因后C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、AP2、SREBP1基因的表达量极显著下调(P＜0.01),HSL极显著上调(P＜0.01);而干扰该基因后C/EBPα、C/EBPβ、AP2、SREBP1、DGAT1基因的表达量极显著上调(P＜0.01),FASN极显著下调(P＜0.01)。综合以上结果表明,GPR35基因可能是山羊皮下前体脂肪细胞分化过程中的一个负向的调控因子,这种作用可能是通过调控C/EBPα、C/EBPβ、AP2、SREBP1的表达或与CXCL17蛋白相互作用来实现的。

旨在探究Snail1基因对于牛脂肪细胞增殖分化的影响及其潜在的作用分子机制。本研究利用腺病毒在秦川牛脂肪细胞中过表达Snail1基因并设置试验组和对照组各3个生物学重复,采用流式细胞术、CCK-8、EdU染色、油红O染色、甘油三酯测定、qRT-PCR和蛋白质印迹等试验方法探究Snail1对牛脂肪细胞增殖和分化的影响;进一步通过RNA-Seq、双荧光素酶报告试验筛选其作用信号通路及靶基因。结果表明,过表达Snail1抑制了细胞增殖(CCK-8)且减少了处于S复制期阳性细胞比例(EdU,P<0.05)。结合流式细胞术试验,结果表明Snail1上调导致了细胞周期G1/S期阻滞。进一步的实时荧光定量PCR和蛋白质印迹结果表明,Snail1抑制了细胞周期蛋白基因CCNB1、CCND2的表达(P<0.05)。对诱导分化第6天牛脂肪细胞进行油红O染色和甘油三酯检测,结果表明Snail1抑制了牛脂肪细胞的成脂分化和甘油三酯的生成。qRT-PCR分析表明,过表达Snail1抑制了PPARγ(P=0.06)、FABP4(P<0.05)、LPL(P<0.05)基因表达,而PIK3R3基因表达水平显著上调(P<0.01);蛋白质印迹结果表明,Snail1表达显著抑制了FABP4蛋白表达。进一步通过RNA-Seq测序分析发现,Snail1过表达引起的差异基因主要富集在PPAR、ECM受体互作、PI3K-AKT、MAPK、尼古丁成瘾及胰岛素分泌等信号通路。基于FIMO靶基因筛选联合RNA-Seq数据分析及荧光素酶试验等证实,转录因子Snail1可能通过靶向Wnt信号通路的拮抗剂SFRP2影响牛脂肪细胞的分化过程。Snail1基因抑制牛脂肪细胞的增殖和分化过程,且可能通过"Snail1/SFRP2-Wnt/β-catenin-GSK3 β"正反馈环参与了牛脂肪细胞分化调控过程。

为了评价蒙古马(Equus mongolian horse)和纯血马(E. thoroughbred)免疫生理机能在适应特殊生存环境和人工选择压力过程中相关基因的表达多样性。本研究对健康成年蒙古马(n=3)和纯血马(n=3)的颈静脉血液进行RNA-Seq和品种间表达谱比较分析。对2岁左右健康蒙古马(n=3)和纯血马(n=3)采集肝脏、脾脏、肺脏和血液样品,利用qRT-PCR方法,分析NF-κB信号通路7个基因在两个品种中的表达情况。利用Western blot方法,分析蒙古马和纯血马肺脏中核因子κB亚基p65 (RELA proto-oncogene NF-kB subunit, NF-κB p65)蛋白和白细胞介素1β (interleukin 1 beta, IL-1β)蛋白的表达情况。结果表明,RNA-Seq共获得19.69~23.95 Gb的高质量数据和1 199个差异表达基因,许多差异表达基因直接参与机体的免疫过程。NF-κB信号通路7个基因在蒙古马和纯血马4个免疫组织中均表达,基因表达的品种间差异存在组织多样性;7个基因在蒙古马肺脏的表达量均高于纯血马,除肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)基因差异不显著外(P≥0.05),其余基因均具有生物学统计意义(P<0.05)。NF-κB p65蛋白和IL-1β蛋白在蒙古马肺脏的表达量高于纯血马(P<0.05)。许多免疫相关基因在蒙古马和纯血马免疫组织之间差异表达,可能和蒙古马适应特定环境以及纯血马的运动性能定向选育有关。本研究结果为进一步研究蒙古马免疫功能适应特定环境的分子机制提供数据支持。

旨在研究莱芜猪盲肠和结肠肠道微生物群落的结构组成、功能以及与杜长大猪的区别,为从肠道菌群层面深入理解莱芜猪高脂肪沉积、耐粗饲和抗逆等特性奠定基础。以12头莱芜猪和6头杜长大猪为试验动物,采用高通量测序技术测定盲肠和结肠微生物菌群16S rRNA V3-V4区序列,分析微生物菌群的组成、丰度和多样性,预测生物功能,通过对莱芜猪和杜长大猪菌群丰度比较分析、LEfSe物种差异判别分析、微生物菌属与背膘厚和血清生化指标相关性分析,鉴定影响莱芜猪品种特性的微生物菌属。结果发现:1)莱芜猪的背膘厚和血清总蛋白、甘油三酯、葡萄糖、高密度脂蛋白胆固醇等指标与杜长大猪存在显著性差异(P<0.05)。2)莱芜猪具有与杜长大猪不同的盲肠和结肠微生物菌群多样性和相对丰度,莱芜猪盲肠微生物菌群的Simpson指数显著高于杜长大猪(P<0.05),盲肠的厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度显著低于杜长大猪(69.16% vs. 89.59%,P<0.05)。3)盲肠和结肠中一些微生物菌属的丰度与背膘厚和部分血清生化指标具有显著相关性(P<0.05),且与这些表型指标相关的盲肠微生物菌属比结肠更多,相关系数也更高,表明盲肠微生物菌群对猪的表型起到了更大的作用。4)甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)和大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、活泼瘤胃球菌([Ruminococcus]_gnavus_group)、拟杆菌属(Bacteroides)等与脂肪沉积、耐粗饲和抗逆性强等有关,可能是影响莱芜猪特性的微生物菌属。本研究阐述了莱芜猪和杜长大猪盲肠和结肠微生物菌群特征,加深了肠道菌群对莱芜猪品种特性影响机理的了解,为地方猪肠道微生物资源的开发与利用奠定基础。

基于前期比较基因组学分析,在香猪的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶4(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 4,MAP3K4)基因第15内含子中发现一个189 bp的结构变异(MAP3K4-I15-sv189)。为探究该结构变异(structural variation,SV)在香猪群体中的多态性分布及其对基因表达的影响,本研究设计一对特异性引物,建立MAP3K4基因SV的PCR检测技术,分析香猪群体中该结构变异的基因类型;采用RT-qPCR研究结构变异不同基因型之间基因的差异表达。结果显示,香猪群体中MAP3K4-I15-sv189位点存在两种基因型,DD型和ID型(D为缺失基因,I与参考基因一致),其中D等位基因的频率为97.35%;大白猪群体中检测到3种基因型,DD型、ID型和II型,D等位基因频率为80%。相比之下,香猪的D等位基因频率显著高于大白猪的相应值(P<0.05)。采用生物信息学方法分析结构变异区域得到多种剪接元件和重复元件,可能影响MAP3K4基因的表达。比较香猪各组织中MAP3K4基因的表达量,发现该基因在肺组织的表达量最高。进一步检测肺组织中3种结构变异类型的相对表达量,显示:DD型>ID型>II型,表明SV的缺失可能促进MAP3K4基因的表达。本研究表明,香猪MAP3K4的结构变异MAP3K4-I15-sv189以缺失型为主,缺失型可促进肺组织MAP3K4基因的表达。研究结果有助于解析香猪易感肺部疾病的分子机制。

旨在研究花生四烯酸脂氧合酶15B(arachidonate lipoxygenase type B, ALOX15B)是否参与了热应激条件下丙二醛(malondialdehyde, MDA)与活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成,进而调控睾丸支持细胞凋亡,以及JNK信号通路(jun amino terminal kinase, JNK)是否在这一过程中发挥了作用。本研究从20只3周龄的三元杂交仔猪的睾丸组织中分离出支持细胞,随机分为3组,每组3个重复,将体外培养的仔猪睾丸支持细胞在44℃条件下处理30 min作为热应激模型,分别转染ALOX15B的siRNA、添加ALOX15B抑制剂(黄芩素)或JNK抑制剂后,运用流式细胞术检测细胞的凋亡率,使用Western blotting检测磷酸化JNK、ALOX15B和p53的蛋白表达,利用ELISA检测8-HETE与15-HETE的含量,采用试剂盒检测MDA和ROS的水平。结果显示,与单独的热应激组相比,黄芩素和热应激联合处理减少了8-HETE和15-HETE的含量(P<0.01),降低了MDA和ROS的水平(P<0.01),抑制了热应激诱导的细胞凋亡率(P<0.01);在热应激条件下,黄芩素和ALOX15B的siRNA均抑制了热应激诱导的JNK的磷酸化(P<0.01);JNK抑制剂SP600125可抑制热应激条件下p53的表达水平(P<0.01),降低细胞凋亡率(P<0.01)。与单独的热应激组相比,SP600125和热应激联合处理反馈抑制了ALOX15B的表达(P<0.01),减少了脂质过氧化物8-HETE(P<0.01)与15-HETE的含量(P<0.05),降低了MDA和ROS的水平(P<0.01)。这表明,在热应激条件下,ALOX15B使MDA和ROS的水平升高,诱导了支持细胞凋亡,JNK通过激活p53参与了ALOX15B调节的支持细胞凋亡;JNK可反馈调节ALOX15B、8-HETE、15-HETE、MDA和ROS的水平。

旨在鉴定绵羊miR-200b的启动子区并研究其对卵泡颗粒细胞线粒体功能的影响。本研究体外分离培养绵羊卵泡颗粒细胞,通过构建包含3个不同长度启动子区重组质粒,利用生物信息软件和双荧光素酶报告试验预测并鉴定绵羊miR-200b核心启动子区;利用在线工具预测转录因子NR4A1的结合位点;通过双荧光素酶报告试验和qRT-PCR检测过表达NR4A1基因对miR-200b启动子活性和表达水平的影响;通过转染miR-200b mimic和mimic NC,分别检测颗粒细胞线粒体形态和数量、线粒体膜电位、ROS水平、ATP和线粒体呼吸链复合物 Ⅰ 的浓度,并检测线粒体氧化磷酸化相关基因表达水平。结果表明,miR-200b-P1(-159/+36 nt)活性最高,确定该区域为miR-200b核心启动子区;预测出核心启动子存在1个NR4A1的结合位点,且过表达NR4A1基因显著上调miR-200b启动子活性和miR-200b的表达水平(P<0.01)。与mimic NC组相比,转染miR-200b mimic导致颗粒细胞平均光密度显著降低(P<0.01),细胞长度显著缩短(P<0.01)、线粒体膜电位下降(P<0.05)、ATP(P<0.05)和线粒体呼吸链体复合物 Ⅰ (P<0.01)的浓度降低、ROS水平升高(P<0.01),同时下调ATP6V1G1和NDUFV1的表达(P<0.01),上调NOX4的表达水平(P<0.01)。该研究确定了绵羊miR-200b的核心启动子区(-159/+36 nt),NR4A1正向调控miR-200b的转录,且miR-200b能够影响线粒体氧化磷酸化过程,诱导颗粒细胞线粒体损伤。该研究结果为进一步揭示miR-200b调控绵羊卵泡发育的机制提供了理论依据。

为了探究山羊繁殖性状的内在分子调控机制以及基因调控网络。本研究选取健康无病的3岁左右、体格大小相似的第3胎次母羊,依据繁殖性能记录,采集3只平均胎产羔数为1只的母羊为单羔组,采集3只平均胎产羔数大于2只的母羊为多羔组。采用转录组测序技术进行mRNA文库构建、单羔组与多羔组间差异表达基因筛选及功能鉴定,通过实时荧光定量PCR技术验证基因表达量。本研究构建了6个槐山羊卵巢组织mRNA文库,平均reads总数为41 163 239条,clean reads数为37 908 182条。差异表达分析在多羔与单羔组间共发现121个差异表达基因(P<0.05),其中上调基因30个,下调基因91个。PTX3、MMP13、PAK1、ADAMTS1、COL1A2、CCN1、SLC4A10、FOS、NR4A1、NR4A2和ADCY8等11个基因在单羔与多羔组间表达差异显著(P<0.05),且参与组织器官结构发育功能及内分泌系统醛固酮、皮质醇、催产素和促肾上腺皮质激素等激素分泌;在上述11个基因中共发现236个SNPs,其中7个SNPs为错义突变,4个位于ADAMTS1基因,1个位于PTX3基因,2个位于CCN1基因。本研究结果表明,11个基因在单羔组与多羔组间表达量差异显著,且参与组织器官结构发育及内分泌系统的激素分泌,可能与山羊卵泡发育、排卵及类固醇激素分泌有关,为阐明槐山羊多胎性状遗传机制提供科学依据。

旨在探究日粮添加腐殖酸钠对肉鸡营养物质表观消化率、粪便微生物数量及其代谢产物的影响。试验选取540只1日龄817白羽肉鸡,随机分为3组(每组6个重复,每个重复30只)。对照组饲喂基础日粮,试验组分别饲喂含0.3%和0.5%腐殖酸钠的试验日粮。试验为期42 d,试验结束前3 d,每个重复选取体重相近的2只肉鸡放入代谢笼,进行代谢试验。结果表明:1)与对照组相比,日粮添加0.5%的腐殖酸钠可显著提高肉鸡对粗蛋白、磷和灰分的表观消化率(P<0.05)。2)与对照组和0.3%组相比,日粮中添加0.5%的腐殖酸钠可显著提高肉鸡粪便中总菌和乳酸杆菌的数量,并降低大肠杆菌的数量(P<0.05)。与0.3%组相比,日粮中添加0.5%的腐殖酸钠可显著提高肉鸡粪便中普雷沃氏菌的数量(P<0.05)。3)与对照组相比,日粮中添加0.5%的腐殖酸钠可显著降低肉鸡粪便中氨态氮的含量,并提高乳酸的含量(P<0.05)。与对照组和0.3%组相比,日粮中添加0.5%的腐殖酸钠可显著降低肉鸡粪便中的对甲酚的含量(P<0.05)。4)与对照组和0.3%组相比,日粮添加0.5%腐殖酸钠可显著降低肉鸡粪便中酪胺、亚精胺、精胺和总生物胺的含量(P<0.05)。与对照组相比,日粮添加0.3%和0.5%腐殖酸钠可显著降低肉鸡粪便中腐胺的含量(P<0.05);此外,日粮添加0.3%腐殖酸钠可显著降低肉鸡粪便中酪胺和精胺的含量(P<0.05)。综上所述,日粮添加一定比例的腐殖酸钠可提高肉鸡对营养物质的表观消化率,促进粪便中有益菌的生长与繁殖,提高粪便中乳酸的含量,抑制有害菌的生长与繁殖;进而降低粪便中氨态氮、对甲酚和生物胺等臭味物质的含量,达到源头减排的目的,且在本试验条件下添加0.5%的效果优于0.3%。

旨在研究羔羊运输前、后不同处理对其宰后肌肉能量代谢的影响,分析运输导致羔羊应激的潜在机制,为缓解动物运输应激、提高动物福利提供参考。选取身体健康、体重相近的4月龄湖羊公羔60只,随机均分成3组:对照组、电解多维组和新霉素组,每组20只。所有试验羊进行8 h长途运输,运输当天记为第0天,对照组饲喂基础饲粮,电解多维组于运输前2 d至运输后7 d在每只羔羊基础饲粮中添加电解多维375 mg·d^-1,新霉素组于第0~7天在运输后对每只羔羊进行新霉素治疗200 mg·d^-1。在第0、7和14天,每组分别任选5只羔羊屠宰,取背最长肌检测其糖酵解潜力(glycolysis potential, GP)及相关基因和蛋白表达量。结果表明:1)试验处理极显著影响了肌糖原水平(P＜0.01),各组大小关系为新霉素组>电解多维组>对照组。时间极显著影响了肌糖原、游离葡萄糖含量和己糖激酶(hexokinase, HK)及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性(P＜0.01),羔羊背最长肌中肌糖原与游离葡萄糖含量在第7和14天明显高于第0天;HK活性先升高后降低,第7天最高;运输结束后14 d内肌肉LDH活性上升,对照组和新霉素组在第7天最高,电解多维组第14天最高。2)处理显著影响了LKB1的基因表达(P＜0.05),各组大小关系为新霉素组>对照组>电解多维组。时间极显著影响了AMPKα1、AMPKα2、LKB1、CPT-1的基因表达(P＜0.01),显著影响了ACC基因及LKB1基因及蛋白表达量(P＜0.05);各组CPT-1及ACC在运输后14 d内基因表达量上升。综上,羔羊运输前、后添加电解多维可改善肌肉能量代谢状态,抑制运输诱导的AMPK途径激活。

旨在探究母鹅日粮添加甜菜碱对子代胸肌发育的影响及机制。将540只体重相近的39周龄江南白鹅随机分为3组,每组5个重复,每个重复36只,公母比为1∶5。对照组(CON)饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中分别添加0.25%(LBT组)和0.5%(HBT组)的甜菜碱,连续饲喂7周,从第7周开始,连续收集7 d种蛋入孵,出雏后每组各选取160只1日龄体重相近的健康雏鹅(公母各半),子代鹅饲喂相同的基础日粮,试验期63 d。分别在第35和63日龄时,每组选择10只屠宰并采集胸肌样品。通过RT-qPCR和Western blot检测胸肌肌纤维类型、生长相关基因和蛋白的表达水平。结果表明:母鹅日粮添加甜菜碱显著增加35日龄HBT组子代鹅体重和胸肌重量(P＜0.01),显著增加63日龄LBT和HBT组子代鹅体重和胸肌重量(P<0.01或P＜0.05),显著增加63日龄HBT组子代鹅胸肌指数(P＜0.05);与对照组相比,母鹅日粮添加甜菜碱显著提高了35日龄LBT及HBT组及63日龄HBT组子代鹅的胸肌肌纤维直径和横截面积(P＜0.05),显著降低35日龄HBT组胸肌肌纤维密度(P＜0.05),同时子代鹅胸肌中LBT组35日龄RNA含量和HBT组35及63日龄RNA和蛋白质也显著升高(P＜0.05);各组间肌纤维类型未发生显著变化,但LBT和HBT组两个日龄胸肌中Pax7 mRNA的相对表达量均显著升高(P＜0.05);35日龄时,HBT组子代鹅胸肌中IGF-2含量显著增加(P＜0.05),且LBT和HBT组IGF-2、IGF-1R和mTOR的mRNA表达水平均显著升高(P＜0.05,除LBT组mTOR P=0.07)。63日龄时,LBT和HBT组子代鹅胸肌中IGF-1和IGF-2含量显著高于对照组(P＜0.05),IGF-1、IGF-2、IGF-1R和mTOR(除LBT组mTOR外)的mRNA表达水平也显著上调(P＜0.05)。此外,母鹅日粮添加甜菜碱显著升高了35日龄子代鹅胸肌中p-mTOR的蛋白表达,以及63日龄HBT组胸肌中的p-AKT和p-mTOR的蛋白表达(P＜0.05)。综上表明,母鹅日粮添加甜菜碱通过激活与IGFs相关的信号通路,促进子代鹅胸肌蛋白质合成,从而增加胸肌重量。

牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)是造成犊牛腹泻的主要病原之一。新疆养牛业发展迅速,国内外引入品种数量日益增多,BCoV感染呈上升态势,但对其流行现状与规律缺乏全面了解。本研究于2020—2022年对新疆南、北疆养牛业主产区BCoV感染的流行情况进行了两年跟踪调查,共采集犊牛腹泻粪样本652份,采用RT-PCR方法进行了BCoV检测。对分离鉴定到的毒株进行了遗传进化分析。结果发现,BCoV总阳性率23.93%(156/652)。BCoV感染呈季节性变化,冬季为主要感染季节,检出率高达50.85%。南疆地区BCoV发病率高于北疆地区。与奶用犊牛相比,肉用犊牛更易感染。遗传进化分析表明:本试验分离到的BCoV毒株暂命名为BCoV/China/XJ-CJ/2022,该毒株的S基因与2018年毒株MN982199.1进化关系最近,N基因与2018年毒株MK095169.1BCOV-China/SWUN/LN4/2018进化关系最近,M基因与2017年毒株MK095148.1 China/SWUN/SC1/2017进化关系最近,HE基因与2017年毒株MK095136.1 BCOV-China/SWUN/SC2/2017进化关系最近。使用软件分析BCoV/China/XJ-CJ/2022与其它国家出现的BCoV毒株之间未出现基因重组现象。经5个结构蛋白的核苷酸和氨基酸相似性分析,发现其基因依然与中国国内本土毒株FJ938064.1_E-AH187-TC相似度最高,分别最低达到91.50%和96.70%。调查结果表明,BCoV在新疆规模化牛场呈现出的季节、地域和品种间的感染差异性可为精准防控策略的制定提供数据支撑。

猪圆环病毒2型(PCV2)作为无囊膜单股负链环状DNA病毒,能引起感染猪的免疫抑制,是猪圆环病毒相关疾病的主要病原体,广泛传播于世界各地,给全球养猪业造成了巨大损失。为探究地西他滨(DAC)对PCV2增殖的影响及其作用机制。本研究构建了感染PCV2的PK-15细胞模型,使用CCK-8法检测DAC对PK-15细胞的细胞毒性,进而使用荧光定量PCR、间接免疫荧光和Western blot检测DAC对PCV2增殖水平的影响;通过间接免疫荧光法标记5甲基胞嘧啶表征DAC对细胞基因组DNA全局甲基化的影响;通过RNA干扰技术在PK-15细胞中沉默DAC的作用靶点DNA甲基转移酶1(Dnmt1),进一步探究DAC抑制PCV2增殖的作用机理。结果显示,DAC在20 μmol·L^-1时才具有轻微的细胞毒性,并在浓度为10 μmol·L^-1时即表现出明显的抗PCV2活性,可以抑制不同时间的PCV2增殖。DAC处理细胞后能显著降低PK-15细胞基因组DNA的甲基化,并诱导Ⅰ型干扰素(Ⅰ-IFN)和干扰素刺激基因(ISGs)的表达。沉默DAC的作用靶点Dnmt1能显著抑制PCV2的增殖,且同样诱导I-IFN和ISGs的表达。本研究证实DAC能够有效抑制PCV2的增殖,且发现DAC能促进I-IFN和ISGs的表达并抑制DNA的甲基化,推测DAC抗PCV2病毒的功能与I-IFN和ISGs的表达上调有关,提示DAC具备开发成PCV2临床抗病毒药物的潜力,还揭示Dnmt1是激活宿主固有免疫抗病毒通路的潜在靶点,为新的PCV2抗病毒药物研发提供理论依据。

本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1) E2 病毒样颗粒(VLPs),并测定其对小鼠的免疫效力。选用BVDV-1 SWU-Z6株的E2基因序列为模板,针对昆虫细胞密码子偏嗜性优化合成E2基因,利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备BVDV-1 E2 VLPs。采用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot验证E2蛋白在SF9细胞中的表达,通过电镜鉴定BVDV-1 E2 VLPs的组装。对获得的VLPs进行超离纯化,使用不同剂量的VLPs添加MF59佐剂和CpG-ODN免疫增强剂肌注免疫小鼠,同时设立BVDV商业灭活苗组和PBS空白对照组。二免4周后选用BVDV-1 SWU-Z6毒株以灌胃途径对小鼠进行攻毒,通过小鼠体重变化以及粪便中的病毒载量来评估BVDV-1 E2 VLPs的免疫保护效果。经酶切鉴定和测序验证表明,优化后的E2基因已正确克隆至杆状病毒穿梭载体pFast Dual中,并获得重组质粒pFast Dual BVDV-1 E2,将重组质粒转化到DH10.Bac感受态细胞经过蓝白斑筛选获得重组杆粒Bacmid-BVDV-1 E2,将重组杆粒转染至SF9细胞,获得重组杆状病毒Baculo-BVDV-1 E2。电镜下观察可见大量直径在80~100 nm的BVDV病毒样颗粒,IFA和Western blot结果证实重组杆状病毒能够正确表达E2蛋白,并具有良好的生物学活性。BVDV-1 E2 VLPs 50 μg组小鼠首免2周时ELSIA抗体效价约为1∶10 000,加强免疫2周后抗体效价达到1∶100 000。攻毒保护试验结果表明,免疫组小鼠在攻毒后第7天表现出体重下降,而后开始回升;在攻毒后第10天采集粪便没有检测到病毒拷贝。与非免疫组小鼠相对比,BVDV-1 E2 VLPs 50 μg剂量两次免疫后阻止了因病毒感染而导致体重下降以及消化道内病毒的复制。研究中成功制备了BVDV-1 E2 VLPs,能诱导机体产生较强的体液免疫反应,可使小鼠获得抵抗BVDV-1 SWU-Z6毒株感染的免疫保护力。

为评价B亚型禽偏肺病毒病灭活疫苗对黄羽肉鸡的免疫保护效果,本研究将制备的灭活疫苗LN16-I株以0.5 mL·只^-1的剂量通过肌肉注射的方式免疫3周龄黄羽肉鸡,免疫后3周,以相同的注射方式和剂量加强免疫1次。采集1~6周内的血清,并测定ELISA抗体效价及中和抗体效价,结果显示,初次免疫后6周,免疫组血清ELISA抗体平均滴度可达4.2×10⁴,平均中和抗体效价可达7.42 log2,阳性率均为100%。加强免疫3周后,使用强毒株LN16对各组鸡进行攻毒,攻毒剂量为5 000 TCID₅₀·只^-1,结果显示,攻毒对照组的鸡出现流混浊或黏稠样鼻涕、甩头等临床症状,发病率为85%(11/13),而免疫组均未发病;进一步通过荧光定量PCR方法检测鼻腔拭子中的病毒拷贝数,结果显示,攻毒对照组在第3天时出现排毒高峰,病毒拷贝数为4.9×10⁶ copies·mL^-1,而免疫组相比于攻毒对照组排毒量下降约99.43%;病理结果显示,攻毒对照组鸡的鼻甲和气管出现明显的病理损伤,而免疫组鸡均未出现病理损伤。本研究结果首次表明,B亚型禽偏肺病毒感染,可引起黄羽肉鸡明显发病,灭活疫苗LN16-I株可以对黄羽肉鸡提供良好的免疫保护效果。本研究为我国黄羽肉鸡B亚型禽偏肺病毒病的流行病学调查研究及有效防控提供了理论支持与技术指导。

利用原核表达系统表达Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)fiber2和8b型(FAdV-8b)fiber全长蛋白、截短蛋白及二价融合蛋白,并评价其免疫原性。基于FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber抗原性好的截短片段(FP和BP),利用SOE-PCR构建二价融合片段(BP-FP),分别对截短蛋白、融合蛋白及全长(FL和BL)在大肠杆菌中进行表达,采用SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行鉴定。纯化后的重组蛋白免疫SPF鸡并攻毒,计算各组存活率、间接ELISA检测免疫鸡血清抗体水平、qPCR检测泄殖腔拭子排毒量和肝脏中细胞因子IL-4、IFN-γ和TNF-α mRNA表达水平以及进行组织病理观察。结果显示:构建的重组质粒均在大肠杆菌中成功可溶表达;BP-FP4组存活率为58.3%,其他组存活率均为100%;全长组(FL组和BL组)抗体水平均高于各自片段组(FP组和BP组),但差异不显著(P＞0.05);攻毒后3 和7 d C8b组排毒量均显著高于免疫组(P＜0.05),攻毒后7 d BP-FP8b组排毒量显著高于BP和BL组(P＜0.05),BL组和BP组差异不显著(P＞0.05);免疫组IL-4、IFN-γ和TNF-α mRNA表达均显著高于阴性对照组(P＜0.05),FL组IFN-γ和TNF-α mRNA表达均显著低于BP-FP4组(P＜0.05),FL组和FP组差异不显著(P＞0.05),BL组IL-4和IFN-γ mRNA表达均显著低于BP-FP8b组(P＜0.05)。组织病理观察发现,攻毒组肝脏病变最严重,FP组与BP组次之,FL组与BL组无明显病变。本研究表明FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber的全长蛋白和截短蛋白免疫保护效果优于融合蛋白,截短蛋白可替代全长蛋白用于制备禽腺病毒亚单位疫苗。

旨在使用鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)的黏附蛋白设计一种更安全、有效的多表位候选疫苗。本研究运用生物信息学方法对鸡毒支原体的多个黏附素蛋白(CrmA、GapA、Mgc2、PvpA)的B、T细胞表位进行预测。将筛选的抗原表位合成新的表位基因肽段(命名为mEA)。通过生物学在线软件分析了mEA的二级结构、亲水性、抗原性、三级结构。构建重组质粒pET32a-MG-mEA,经限制性内切酶(BamH Ⅰ和Hind Ⅲ)酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达和纯化。Western blot验证重组蛋白与鸡MG阴性/阳性血清的反应性。纯化的MG-mEA重组蛋白与佐剂1∶1混匀,制备为多表位疫苗,通过SPF鸡免疫试验分析融合蛋白免疫原性。结果显示,mEA序列二级结构较稳定,抗原性良好。重组质粒经PCR扩增获得1 680 bp大小的目的条带,与预计相符。SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约48 ku,主要以可溶性形式存在。Western blot试验证明该蛋白反应原性良好。多表位疫苗免疫SPF鸡,经ELISA检测显示:二免后10 d各免疫组抗体水平达到最高,3个重组蛋白免疫组与PBS组相比差异均具有显著统计学意义 (P<0.05)。攻菌结果表明,MG感染明显损伤了气管黏膜结构,而重组蛋白+佐剂制备的疫苗能够有效保护MG的损伤。综上,本研究结果为研制安全有效的候选MG疫苗提供了新的途径。

本研究从2021年海南省两个奶牛场采集的52份样本中分离肠杆菌科细菌,并对分离菌株进行了毒力基因、质粒型和生物被膜形成能力检测及肠杆菌科细菌基因间重复序列分子分型(ERIC-PCR)研究,以期明确牛奶及奶牛场环境中肠杆菌科细菌分布流行状况及其生物学特性。首先,采用16S rDNA PCR和ERIC-PCR对分离的肠杆菌科细菌进行鉴定和去重,结果显示52份样本中分离到肠杆菌科细菌49株,其中大肠埃希菌(Escherichia coli)32株,肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)13株,阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)3株,产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)1株;其次,采用PCR方法进行了分离菌株的毒力基因检测,结果显示,ompA的检出率最高;之后,采用CARATTOLI创建的基于PCR的质粒复制子分型,结果显示K质粒的检出率最高;采用刚果红琼脂法对分离菌株进行了生物被膜形成能力定性检测,发现49株肠杆菌科细菌中有37株指示有生物被膜形成能力;最后,通过ERIC-PCR分型进行了肠杆菌科细菌的亲缘关系和遗传多样性分析,发现49株肠杆菌科菌株可划分为17型(Ⅰ~ⅩⅦ),Ⅵ型为优势型(均为Escherichia coli),共20株。整体研究表明肠杆菌科细菌在奶源环境中广泛存在、生物特性多样,推测具有一定的致病力和耐药性,引起人类和动物疾病风险较高,提示养殖、运输中的卫生和规范操作至关重要。

兔感染肺炎克雷伯菌后,常引起多发性呼吸道疾病及消化系统疾病,严重危害家兔健康养殖。本研究通过剖检河南某兔场疑似病死兔并采集各组织,采用病菌形态学观察、PCR鉴定及测序分析对病原菌进行分离鉴定,并通过毒力基因检测、组织病理学观察、药敏试验及致病性试验以期确定病原菌并对其进行分析。结果显示,经细菌分离培养得到革兰阴性、卵圆形的可疑致病菌;16S rRNA基因扩增片段为1 494 bp,与ON925022.1同源性为99.79%,表明病兔为肺炎克雷伯菌感染。组织病理学观察发现,病兔多数器官肿大、出血,肺泡壁大量炎性细胞浸润,肠绒毛黏膜上皮脱落。毒力基因扩增显示allS、kfu和uge基因为阳性。药敏试验结果显示,该病原菌对丁胺卡那、多黏菌素B、头孢哌酮及头孢曲松4种药物敏感,对其他药物均有不同程度的耐药性。综上表明,引起该兔场发病的病原为肺炎克雷伯菌,本试验为更好地预防和控制兔肺炎克雷伯菌病提供参考。

旨在研究环二鸟苷酸(c-di-GMP)通路代谢基因STM1827对鼠伤寒沙门菌生物被膜的调控及其相关生物学功能。首先通过测定c-di-GMP水平分析STM1827对c-di-GMP合成的影响;进一步通过生物被膜及运动性等试验分析STM1827对生物被膜形成的作用;最后通过氧胁迫和消毒剂胁迫等试验分析STM1827对鼠伤寒沙门菌环境应激适应能力的影响。结果显示,缺失株269ΔSTM1827胞内c-di-GMP水平与野生株相比升高了33.16%;在生物被膜形成方面,缺失株269ΔSTM1827生物被膜形成能力与野生株相比上调了2.19倍,生物被膜相关胞外多糖含量增加1.3倍,且胞外多糖合成基因表达量显著升高(P<0.000 1);在运动性方面,与野生株相比,269ΔSM1827运动性降低了13%,鞭毛相关基因表达量显著降低(P<0.05);在氧应激和消毒剂应激条件下,STM1827基因缺失增强鼠伤寒沙门菌在氧胁迫和SDS消毒剂胁迫下的适应能力。研究表明,STM1827可以降解c-di-GMP,且通过抑制胞外多糖的合成与促进细菌运动性,进而抑制生物被膜形成,最终导致细菌在氧胁迫和消毒剂胁迫下的耐受性降低。本研究为鼠伤寒沙门菌病作用靶点的筛查和防控措施的开发提供理论基础。

旨在研究撒坝猪源E. coli高致病性毒力岛(highly pathogenic virulence island, HPI)诱导IPEC-J2细胞焦亡的机制,本研究以LPS+ATP为阳性对照,将实验室前期筛选的E.coli HPI及通过CRISPR/Cas9基因敲除技术构建完成的E. coliΔHPI感染IPEC-J2细胞,观察细胞损伤情况;RT-qPCR测定各组作用0.5、3、6、9、12 h后细胞内焦亡通路中关键因子NOD样受体家族热蛋白结构域相关蛋白3 (NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)、胱天蛋白酶-1 (caspase-1)、消皮素D (gasderminD, GSDMD)及炎性因子白介素-18 (IL-18)、白介素-1β (IL-1β)的mRNA转录水平;激光共聚焦观察NLRP3/Caspase-1炎性复合体组装及表达情况;Western blot测定GSDMD及其活化形式GSDMD-N蛋白表达水平,PI染色检测胞膜完整性。结果表明:LPS+ATP处理显著促进细胞焦亡的发生,阴性对照组细胞正常生长、轮廓清晰,E. coli感染组及LPS+ATP组细胞出现变形、脱落、边界模糊等明显细胞病变效应(cytopathic effect, CPE),且HE染色显示,E.coliHPI感染相较于E. coli ΔHPI感染对细胞的损伤更严重;E. coli HPI组中的焦亡通路关键因子及炎性因子mRNA水平在3~9 h均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于E. coli ΔHPI组;NLRP3/Caspase-1炎性复合体在细胞质中发生组装,且E. coli HPI组NLRP3/Caspase-1蛋白荧光强度、GSDMD、GSDMD-N蛋白表达水平及PI染色阳性率均极显著(P<0.01)高于E. coli ΔHPI组;E. coli HPI组的CPE、HE染色、焦亡通路关键因子及炎性因子mRNA水平、GSDMD及GSDMD-N蛋白表达量、NLRP3/Caspase-1共定位情况均与LPS+ATP组相似。结果提示,撒坝猪源E.coliHPI通过上调NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路中关键因子mRNA水平,诱导NLRP3/Caspase-1炎性复合体的组装,促进焦亡标志蛋白GSDMD及GSDMD-N的表达,并对IPEC-J2细胞膜进行打孔,从而诱导细胞发生焦亡。

旨在分离沙门菌烈性噬菌体,为细菌病的防控提供新型生物制剂。以沙门菌为宿主分离筛选烈性噬菌体,并对其生物学特性和基因组进行研究。结果显示:分离筛选到一株烈性噬菌体,命名为沙门菌噬菌体SP3,头部呈多面体,直径为70 nm,具有收缩性的尾巴,长约130 nm;SP3是一株宽谱噬菌体,可以裂解3个血清型共8株沙门菌;最佳感染复数为0.000 1,潜伏期为40 min,爆发期为40~160 min;SP3在≤50 ℃,pH为4~11时稳定。噬菌体SP3基因组全长88 039 bp,GC含量为38.85%,含有22个tRNA,130个ORF,其中32个编码功能已知的蛋白,不携带耐药、毒力和溶原有关基因;SP3与同属于Ounavirinae亚目、Felixounavirus属的大肠杆菌噬菌体和沙门菌噬菌体亲缘关系很近,且基因组存在重排现象。噬菌体SP3环境适应性强,遗传背景清楚,以期成为沙门菌防控的抗生素替代品。

旨在探究邻苯二甲酸二-2-乙基己酯[di (2-ethylhexyl) phthalate, (DEHP)]暴露通过ROS/PTEN/PI3K/AKT通路诱导细胞凋亡和程序性坏死的作用机制。本试验以HD11细胞为研究对象,设置对照组(C组)、30 μmol·L^-1 DEHP组(L组)、60 μmol·L^-1 DEHP组(M组)和90 μmol·L^-1 DEHP组(H组)。用不同浓度的DEHP处理HD11细胞24 h后,采用CCK-8检测细胞存活情况,生化试剂盒检测氧化应激指标,包括活性氧(ROS)水平,丙二醛(MDA)含量与总抗氧化能力(T-AOC)水平,以及总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。采用AO/EB染色和流式细胞术检测凋亡率和坏死率,荧光定量RT-PCR和Western blot法检测PTEN/PI3K/AKT通路基因及凋亡与坏死相关基因的mRNA和蛋白表达,结果表明,与对照组相比,DEHP暴露可显著抑制HD11细胞的活力,且半数抑制浓度(IC₅₀)为180.644 μmol·L^-1。与对照组相比,L、M、H DEHP组AO/EB染色和流式细胞术结果显示DEHP暴露导致HD11细胞具有典型的凋亡和坏死特征。与对照组相比,L、M、H DEHP组ROS水平呈现上升趋势(P<0.01),L、M、H DEHP组MDA含量显著升高(P<0.01),而T-AOC水平显著降低(P<0.01),T-SOD和GSH-PX活性显著降低(P<0.01),提示DEHP暴露诱导HD11细胞发生氧化应激损伤。此外,与对照组相比,DEHP暴露上调了PTEN/Bax/Caspase-3/Caspase-9/RIPK1/RIPK3/MLKL的mRNA和蛋白表达(P<0.01),而 PI3K/AKT/BCL-2的mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01),提示DEHP暴露通过PTEN/PI3K/AKT信号通路诱导HD11细胞凋亡和程序性坏死。综上所述,DEHP可以通过调控ROS/PTEN/PI3K/AKT轴诱导HD11细胞凋亡和程序性坏死,并存在明显的剂量-效应关系。

旨在探明丹参单体成分丹参素在骨骼肌损伤后修复中的作用,以期为临床治疗提供理论依据。本试验建立骨骼肌损伤模型,设置丹参素治疗组,通过HE染色和Masson染色观察肌纤维修复过程,Western blot和Q-PCR方法检测肌再生相关因子(α-Actinin、eMyHC、MyoD、MyoG、Pax7和MSTN),炎症相关因子(IL-6和IL-10),巨噬细胞类型相关因子(F4/80),瘢痕组织形成相关因子(Collagen Ⅰ和α-SMA)及肌间脂肪相关因子PPAR-γ的表达。结果显示,丹参素降低损伤组腓肠肌对Evans blue的摄取,显著增加α-Actinin和eMyHC因子的表达水平。与损伤组相比,肌肉再生相关因子MyoD、MyoG和Pax7的表达水平在丹参素治疗之后显著升高,而MSTN显著减少。丹参素显著降低损伤组F4/80的表达,加快M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化,降低IL-6 mRNA水平,增加IL-10 mRNA水平。Masson染色结果显示,丹参素减少受损骨骼肌胶原纤维的分布,并且降低Collagen Ⅰ和α-SMA的表达。同时,丹参素显著增加肌间脂肪因子PPAR-γ的表达。因此,丹参素能够加快肌纤维的再生,促进肌间脂肪的形成,减少纤维化瘢痕的生成,从而加快骨骼肌修复进程,提高骨骼肌修复质量。

旨在验证麻杏石甘口服液对人工感染鸡毒支原体治疗效果。将87只1日龄健康鸡按常规饲养至20日龄,随机分为感染对照组、空白对照组和治疗组。空白对照组正常饲喂,不感染。感染对照组和治疗组的试验鸡通过滴鼻、点眼、气囊注射鸡毒支原体M17菌液共1.5 mL(10⁹ CCU·mL^-1),1次·d^-1,连续感染4 d。在感染的第5天(D1),治疗组经每升水1.5 mL麻杏石甘口服液饲喂治疗,连用5 d,停药后观察6 d。观察给药前1 d(D0)~D11各组鸡的呼吸、咳嗽、流涕、甩鼻、采食和精神状态等临床症状并进行评分,计算临床症状总评分、痊愈率、有效率和无效率。于D0和D12称量试验鸡体重,计算平均增重。分别于D2、D6、D12,每组剖检试验鸡6只,观察肺和气囊病理变化,并采集肺进行组织病理学观察。结果显示:治疗组临床症状总评分在D3开始明显降低(P<0.05);治疗组在D2、D6、D12,肺和气囊病变评分均显著低于感染对照组(P<0.05),肺的组织病理学病变评分也显著低于感染对照组(P<0.05),空白对照组未见异常;治疗组的痊愈率为76.5%,有效率94.1%,无效率为5.9%。感染对照组和治疗组的平均增重显著低于空白对照组(P<0.05)。麻杏石甘口服液可明显改善肉鸡气囊和肺组织病理损伤,对人工感染鸡毒支原体的肉鸡有较好的治疗效果。

本研究以槟榔深加工过程中产生的副产物槟榔籽为研究对象,采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道肼高分辨质谱法(UHPLC-QE-Orbitrap-MS)对槟榔籽的成分进行分析鉴定。采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),以0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)为流动相进行梯度洗脱,流速0.3 mL·min^-1,柱温35 ℃,进样体积10 μL,使用电喷雾离子源(ESI),扫描范围m/z为100~1 200,Full MS-ddMS²检测模式,正负离子同时采集。利用Compound Discoverer 3.3软件对原始数据进行分析,通过本地数据库和mzCloud在线数据库对化合物进行结构鉴定。试验鉴定出85种存在于槟榔籽中的成分,分别为生物碱类化合物3种、黄酮类化合物24种、有机酸类化合物15种、酚类化合物7种、萜类化合物7种、氨基酸类化合物6种、糖类化合物4种、酯类化合物4种、酰胺类化合物2种、鞘脂类化合物2种、类固醇衍生物1种、苯丙素类化合物1种、香豆素类化合物1种、其它8种。UHPLC-QE-Orbitrap-MS检测技术可以对槟榔深加工副产物槟榔籽中的成分进行快速识别,本研究为槟榔资源进一步综合利用,开发高附加值产品提供科学依据。

本研究旨在利用宏基因组学深入分析上海某鸽场青年鸽(RP)和产鸽(LP)粪便样品的微生物菌群差异。结果显示,肉鸽肠道菌群的优势菌门为厚壁菌(Firmicutes)、变形菌(Proteobacteria)和放线菌(Actinobacteria)。RP组中双歧杆菌(Bifidobacterium)、棒状杆菌(Corynebacteriun)、嗜冷杆菌(Psychrobacter)、链球菌属(Streptococcus)含量显著高于LP组,而LP组金黄色葡萄球菌属(Staphyloccus)、短状杆菌属(Brachybacterium)、库特氏菌属(Kurthia)和埃希氏菌属(Escherichia)含量显著高于RP组。LEfSe分析显示,LP和RP组的差异表达基因主要富集于5个KEGG通路。抗生素耐药基因(antibiotic resistance genes,ARGs)鉴定显示,肉鸽体内存在198种ARGs,其中多重耐药类ARGs流行率40%以上,说明该场肉鸽抗生素耐药情况较严重。本研究为后续深入研究肠道菌群与健康养殖、抗生素耐药机制等提供了科学数据。

旨在对萨能奶山羊的体尺性状进行多元逐步回归与生长曲线拟合分析,探究不同体尺间的相关与回归关系,并构建体尺性状的生长曲线,为揭示萨能奶山羊体尺的发育规律提供理论基础,为规模化羊场奶山羊选种选配和生产管理提供实际参考。研究以874只不同月龄、性别的健康萨能奶山羊为研究对象,测定了11个体尺性状,包括体高、体斜长、胸围和管围4个一般体尺性状;尻斜长、尻宽和睾丸周径3个反映公羊繁殖性能的性状;乳房围度、乳房深度、乳头间距和乳房距地面高度4个乳房性状。利用主成分分析分别对以上3类性状进行降维,通过多元逐步回归构建一般体尺性状对反映公羊繁殖性能性状和母羊乳房性状的回归方程,利用Bertalanffy模型对一般体尺性状进行生长曲线的拟合。结果表明:1)3类性状内部之间均存在极显著的相关性(P<0.01),且降维后第一个主成分均代表整体的外貌因子,母羊乳房性状中第二主成分可以解释为关于后躯高度的因子。2)一般体尺性状对反映公羊繁殖性能性状的多元逐步回归拟合度较高,为0.76~0.87,而对母羊乳房性状回归拟合度仅为0.15~0.40。3)Bertalanffy对一般体尺性状的拟合效果好,除母羊管围的拟合度为0.60,其余均在0.75以上,且公羊的体尺增长快于母羊。综上可知,萨能奶山羊体尺性状间存在相关性,公羊一般体尺性状可以较准确地预测反映公羊繁殖性能的性状,Bertalanffy模型可较好地拟合一般体尺性状。

旨在研究1-甲基海因(1-methylhydantoin, MH)对钠离子通道(Nav channels, Navs)1.8的干预作用,为临床科学治疗疼痛提供理论依据,为实现"疼痛最小化"终极目标拓宽途径。选取60只SPF级SD大鼠通过随机分组设计,各组分别使用1-甲基海因(MH组)、利多卡因(L组)、氨溴索(A组)处理,第21和28天使用蛋白免疫印记法检测大鼠L4~L6段背根神经节(dorsal root ganglia, DRG)Nav1.8的蛋白表达,采用全细胞膜片钳技术检测MH作用下的Nav1.8通道峰电流。结果表明,与M组相比,MH能使Nav1.8表达显著下降(P<0.05)。MH对Nav1.8通道峰电流具有一定抑制作用,10和100 μmol·L ^-1 MH对Nav1.8的电流抑制率分别为6.34%±3.13%和14.6%±1.52%,具有量效关系。提示MH能够下调慢性疼痛大鼠DRG中Nav1.8的表达,同时抑制Nav1.8电流,进而产生镇痛作用。