霍乱弧菌DncV蛋白的原核表达及活性分析

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.026

畜牧兽医学报 ›› 2015, Vol. 46 ›› Issue (5): 868-872.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.026

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霍乱弧菌DncV蛋白的原核表达及活性分析

韩莹倩，孔江南，王江，张超，杨国宇^*

（河南农业大学农业部动物生化与营养重点开放实验室，郑州 450002）

收稿日期:2014-09-09 出版日期:2015-05-23 发布日期:2015-05-23
通讯作者: 杨国宇，教授，博士生导师，E-mail：haubiochem@163.com
作者简介:韩莹倩（1990-），女，蒙古族，内蒙古呼伦贝尔人，硕士生，主要从事动物生物技术研究，E-mail：twgjl@163.com
基金资助:
农业部948重点计划（2011-G35）；河南省重点科技攻关（112102310705）

Prokaryotic Expression and Activity Analysis of DncV from Vibrio Cholera

HAN Ying-qian，KONG Jiang-nan，WANG Jiang，ZHANG Chao，YANG Guo-yu^*

（Key Laboratory of Animal Biochemistry and Nutrition，Ministry of Agriculture，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）

Received:2014-09-09 Online:2015-05-23 Published:2015-05-23

摘要/Abstract

摘要：

DncV（VC0179）是在霍乱弧菌中发现的一种双核苷酸环化酶，其可以合成c-di-AMP、c-di-GMP和c-GAMP。研究发现c-di-GMP作为胞内的第二信使，通过STING信号通路激活先天性免疫应答。为了体外制备c-di-GMP用于深入研究其功能，构建了VC0179融合cherry标签的丙酸诱导型表达载体，并将该重组表达载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）中。利用丙酸钠诱导表达后，观察菌体颜色是否为红色判断融合蛋白质的表达。超声破碎细菌后经SDS-PAGE电泳检测融合蛋白质的可溶性表达。最后通过Ni-NTA Agarose亲和纯化重组蛋白质，获得的重组蛋白质进行体外酶促反应，高效液相色谱检测合成产物c-di-GMP。结果表明：成功构建VC0179丙酸诱导型原核表达载体并获得了高纯度的VC0179重组蛋白质。该重组蛋白质通过体外酶促反应可一步生成c-di-GMP。本试验建立了稳定获得具有酶活性的VC0179重组蛋白质的方法；c-di-GMP的体外合成为其后续功能研究及大量制备奠定基础。

Abstract:

DncV（VC0179） is the member of a new family of di-nucleotide cyclases in Vibrio cholera and it can catalyzes the synthesis of c-di-AMP，c-di-GMP and c-GAMP.c-di-GMP serves as the second messenger molecule to activate the innate immunity through STING signaling pathway.To generate c-di-GMP in vitro and further investigate its functions，we constructed the propionate-inducible VC0179 prokaryotic expression plasmid fused with cherry-Tag.The recombinant plasmid was transformed into E.coil BL21（DE3） and induced by propionate.The expression of recombinant protein was observed by red color.SDS-PAGE analysis was used to identify the soluble expression of recombinant protein after ultrasonic decomposition.Moreover，c-di-GMP was enzymatically synthesized in vitro with the recombinant protein purified by Ni-NTA purification system and detected by high performance liquid chromatography.We successfully constructed the propionate-inducible VC0179 prokaryotic expression plasmid and acquired the high quality fusion protein，which could catalyze the synthesis of c-di-GMP in vitro by a one-step process.These results suggested that we established a method to generate enzymatically active VC0179 recombinant protein.The synthesis of c-di-GMP in vitro could facilitate the functional study and high volume production of c-di-GMP.

中图分类号:

S852.61

韩莹倩，孔江南，王江，张超，杨国宇. 霍乱弧菌DncV蛋白的原核表达及活性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(5): 868-872.

HAN Ying-qian，KONG Jiang-nan，WANG Jiang，ZHANG Chao，YANG Guo-yu. Prokaryotic Expression and Activity Analysis of DncV from Vibrio Cholera[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2015, 46(5): 868-872.

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参考文献

［1］DAVIES B W，BOGARD R W，YOUNG T S，et al.Coordinated regulation of accessory genetic elements produces cyclic di-nucleotides for V.cholerae virulence［J］.Cell，2012，149（2）：358-370.
［2］TAMAYO R，PRATT J T，CAMILLI A.Roles of cyclic diguanylate in the regulation of bacterial pathogenesis［J］.Annu Rev Microbiol，2007，61：131-148.
［3］ALONI Y，COHEN R，BENZIMAN M，et al.Solubilization of the UDP-glucose：1，4- beta-D-glucan 4-beta-D-glucosyltransferase（cellulose synthase） from Acetobacter xylinum.A comparison of regulatory properties with those of the membrane-bound form of the enzyme［J］.J Biol Chem，1983，258（7）：4419-4423.
［4］ALONI Y，DELMER D P，BENZIMAN M.Achievement of high rates of in vitro synthesis of 1，4-beta-D-glucan：activation by cooperative interaction of the Acetobacter xylinum enzyme system with GTP，polyethylene glycol，and a protein factor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1982，79（21）：6448-6452.
［5］JENAL U，MALONE J.Mechanisms of cyclic-di-GMP signaling in bacteria［J］.Annu Rev Genet，2006，40：385-407.
［6］HENGGE R.Principles of c-di-GMP signalling in bacteria［J］.Nat Rev Microbiol，2009，7（4）：263-273.
［7］SUN L，WU J，DU F，et al.Cyclic GMP-AMP synthase is a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway［J］.Science，2013，339（6121）：786-791.
［8］BURDETTE D L，MONROE K M，SOTELO-TROHA K，et al.STING is a direct innate immune sensor of cyclic di-GMP［J］.Nature，2011，478（7370）：515-518.
［9］WU J，SUN L，CHEN X，et al.Cyclic GMP-AMP is an endogenous second messenger in innate immune signaling by cytosolic DNA［J］.Science，2013，339（6121）：826-830.
［10］ISHII K J，CHOON K T.Biological DNA sensor：The Impact of Nucleic Acids on Diseases and Vaccinology［C］.Waltham：Elsevier，2014：33.
［11］PARVATIYAR K，ZHANG Z，TELES R M，et al.The helicase DDX41 recognizes the bacterial secondary messengers cyclic di-GMP and cyclic di-AMP to activate a type I interferon immune response［J］.Nat Immunol，2012，13（12）：1155-1161.
［12］CHEN W，KUOLEE R，YAN H.The potential of 3′，5′-cyclic diguanylic acid（c-di-GMP） as an effective vaccine adjuvant［J］.Vaccine，2010，28（18）：3080-3085.
［13］PEDERSEN G K，EBENSEN T，GJERAKER I H，et al.Evaluation of the sublingual route for administration of influenza H5N1 virosomes in combination with the bacterial second messenger c-di-GMP［J］.PLoS One，2011，6（11）：e26973.

[1]	吕若一, 司晓慧, 孙志刚, 史晓敏, 刘晓晔. 猪链球菌耐药现状分析及感染防控措施[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 4920-4933.
[2]	支岩, 梅晨, 刘珍邑, 乌云格日乐, 王宏俊, 胡格. 副鸡禽杆菌毒力因子研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 4934-4942.
[3]	王佳宁, 张自强, 孔德婧, 冯彩彩, 张飞可, 刘玉梅. 家兔肺炎克雷伯菌的分离鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 5198-5206.
[4]	李莉莉, 陈凯风, 陈兵, 周洲平, 王南威, 瞿孝云, 徐成刚, 廖明, 张建民. STM1827在鼠伤寒沙门菌生物被膜形成及环境应激中的调控作用[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 5207-5217.
[5]	杨梦林, 郑世奇, 彭凯, 王玮, 黄燕华, 彭杰. 鸽源鼠伤寒沙门菌的分离鉴定及致病性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(11): 4880-4888.
[6]	武周慧, 王瑜, 杜衡, 王之文, 肖爽, 武金亮, 王真. 替拉扎明对多重耐药沙门菌抗菌增敏活性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(10): 4362-4371.
[7]	刘鑫欢, 恽佳蕾, 毛立, 李基棕, 郝飞, 何苗锋, 杨蕾蕾, 张纹纹, 程子龙, 孙敏, 刘茂军, 王少辉, 白娟, 李文良. 羊腹泻样本中大肠杆菌的分离、毒力基因与耐药性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(8): 3445-3454.
[8]	胡秀花, 孙芷馨, 赵梦洋, 谢佳琪, 王敏, 陈海良, 葛昕, 刘天龙, 王少林. 野生松鼠源屎肠球菌的致病性与耐药性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(7): 3012-3021.
[9]	赵菲菲, 李杰, 韩宁, 谢仕廷, 曾振灵. 分离自屠宰场的肺炎克雷伯菌的耐药性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(7): 3044-3053.
[10]	陈松彪, 尚珂, 杜付熙, 余祖华, 李静, 贾艳艳, 廖成水, 张春杰, 丁轲, 程相朝. 沙门菌VI型分泌系统组装、结构特征和分泌调控网络的研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(6): 2252-2263.
[11]	曾成容, 王娜, 毕文文, 梅世慧, 何广霞, 张峻杰, 陈泽, 文明, 周碧君. A型产气荚膜梭菌感染鸭回肠代谢组学分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(6): 2555-2569.
[12]	李蔚, 张强, 瞿嘉豪, 吴亚平, 胡若辰, 贾若艺, 郭如海, 马清义, 潘广林, 王兴龙. 大熊猫肠道菌群年龄演替规律分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(6): 2619-2630.
[13]	翟云逸, 袁野, 李俊玫, 田路路, 刁梓洋, 李彬, 陈家露, 周栋, 靳亚平, 王爱华. 布鲁氏菌外膜蛋白16单克隆抗体的制备及初步应用[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(5): 2083-2091.
[14]	田艳红, 于江旭, 焦宇洲, 高东阳, 蔡旭旺. 沙门菌脂多糖的结构修饰及其效应的研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(4): 1392-1402.
[15]	陈烨馨, 谢梦圆, 李文豪, 张志丹, 王晓丹, 陈柯佳, 刘平平, 周伟光, 王建龙, 徐晓静. 牛轮状病毒和志贺菌阳性犊牛腹泻粪便样本中肠道菌群的分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(4): 1624-1631.

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