ssc-miR-148a启动子克隆及其特征分析

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.004

畜牧兽医学报 ›› 2016, Vol. 47 ›› Issue (10): 1969-1976.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.004

ssc-miR-148a启动子克隆及其特征分析

王萍¹，郝文艳¹，曹丽华¹，沈开元¹，代小丽¹，李海艳¹，梁贤威²，石德顺^1*，李湘萍^1*

（1.广西大学，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530005；2.中国农业科学院广西水牛研究所，南宁 530001）

收稿日期:2015-11-19 出版日期:2016-10-23 发布日期:2016-10-23
通讯作者: 李湘萍，研究员，博士生导师，E-mail：xiangpingli@163.com；石德顺，研究员，博士生导师，E-mail：ardsshi@gxu.edu.cn
作者简介:王萍(1987-)，女，山东济宁人，博士，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：wangping.online@163.com
基金资助:
广西壮族自治区研究生教育创新计划项目（YCBZ2014013）；国家自然科学基金（31560632）；广西自然科学基金项目（2014GXNSFAA118084）；广西水牛遗传繁育重点实验室开放课题项目（SNKF-2014-03）

Cloning and Analysis of ssc-miR-148a Promoter

WANG Ping¹，HAO Wen-yan¹，CAO Li-hua¹，SHEN Kai-yuan¹，DAI Xiao-li¹，LI Hai-yan¹，LIANG Xian-wei²，SHI De-shun ^1*，LI Xiang-ping ^1*

(1.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresource，Guangxi University，Nanning 530005，China；2.Buffalo Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530001，China)

Received:2015-11-19 Online:2016-10-23 Published:2016-10-23

摘要/Abstract

摘要：

为研究猪miR-148a（ssc-miR-148a）的转录调控机制，对其启动子进行了克隆及分析。本试验首先设计特异性PCR扩增引物，分别得到ssc-miR-148a前体上游3个片段，并将其连接到荧光素酶报告载体pGL3-Basic上。通过生物信息学方法，在线分析ssc-miR-148a启动子大概区域、甲基化部位和转录因子结合部位。将重组报告质粒转染293T细胞，分析启动子活性。采用不同浓度碱性成纤维生长因子（bFGF）处理猪成纤维细胞和转染有重组报告质粒的猪成纤维细胞，检测ssc-miR-148a和DNA甲基化转移酶1（DNMT1）的表达，及其对启动子活性的影响。结果显示，克隆得到的ssc-miR-148a启动子区2 043 bp片段具有启动子活性，该序列存在5个CpG岛、Sp1及AP2等转录因子结合位点。 0、5和10 ng•mL^-1浓度bFGF处理猪成纤维细胞和转染重组报告质粒的猪成纤维细胞后，ssc-miR-148a表达均显著下降（P<0.05），DNMT1 mRNA显著增加（P<0.05）。启动子活性均显著下降（P<0.05），5和10 ng•mL^-1浓度间无显著差异（P>0.05）。结果表明，ssc-miR-148a启动子位于前体上游2 043 bp片段内，启动子区域有转录因子SP1结合位点，其表达受bFGF的调控。

Abstract:

In order to understand the transcriptional regulatory mechanism of ssc-miR-148a，we have cloned and analyzed its promoter.Firstly，we designed specific PCR primers to amplify 3 upstream fragments of ssc-miR-148a precursors，then inserted them into pGL3-Basic expression vector.Based on the amplified fragments，ssc-miR-148a promoter region，methylation sites and transcription factor binding sites were predicted by bioinformatics.The plasmid was transfected into 293T cells to analyze the promoter activity.Expression of ssc-miR-148a and DNA methylation transferase 1 (DNMT1) in treated porcine fibroblasts by Basic Fibroblast Growth Factor（bFGF）with different concentrations was detected.The results showed that the cloned 2 043 bp sequence had promoter activity，which had 5 CpGs and transcriptional factor binding sites，such as Sp1，AP2.After treated porcine fibroblasts with 0，5 and 10 ng•mL^-1 bFGF，the expression of ssc-miR-148a was decreased significantly（P<0.05），DNMT1 mRNA level increased significantly (P<0.05).The promoter activity significantly reduced (P<0.05)，but no significant difference between 5 and 10 ng•mL^-1 concentrations (P>0.05).The results indicate that the promoter region of ssc-miR-148a locate at －2 043 bp，which has Sp1 transcription factor binding sites.The expression of ssc-miR-148a is regulated by the bFGF.

中图分类号:

S828
S813.3

王萍，郝文艳，曹丽华，沈开元，代小丽，李海艳，梁贤威，石德顺，李湘萍. ssc-miR-148a启动子克隆及其特征分析[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(10): 1969-1976.

WANG Ping，HAO Wen-yan，CAO Li-hua，SHEN Kai-yuan，DAI Xiao-li，LI Hai-yan，LIANG Xian-wei，SHI De-shun，LI Xiang-ping. Cloning and Analysis of ssc-miR-148a Promoter[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2016, 47(10): 1969-1976.

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