利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.016

畜牧兽医学报 ›› 2016, Vol. 47 ›› Issue (4): 762-770.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.016

利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用

余深翼，赵金荣，郑玲红，朱二鹏，周五朵，吴宝成^*

（福建农林大学动物科学学院预防兽医实验室，福州 350002）

收稿日期:2015-10-10 出版日期:2016-04-23 发布日期:2016-04-23
通讯作者: 吴宝成，研究员，硕士生导师，E-mail: bc20020212@163.com
作者简介:余深翼（1990-），男，福建福州人，硕士生，主要从事畜禽新发疫病诊断和防治技术研究，E-mail: yushenyi2014@163.com
基金资助:
福建省畜禽新发疫病诊断和防治技术研究（ky0040052）

The Application of CRISPR/Cas 9 Technology for aroA Gene Knockout in Escherichia coli

YU Shen-yi，ZHAO Jin-rong，ZHENG Ling-hong，ZHU Er-peng，ZHOU Wu-duo，WU Bao-cheng^*

(College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China)

Received:2015-10-10 Online:2016-04-23 Published:2016-04-23

摘要/Abstract

摘要：

旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统，并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异。首先构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9载体；随后人工设计同源修复供体基因序列，并亚克隆到CRISPR/Cas 9载体中，构建成完整的CRISPR/Cas 9基因敲除体系；将该系统分别应用到大肠杆菌DH10B、DH5α和JM109细胞中，PCR鉴定筛选到的阳性菌株，并回收其扩增条带进行克隆、测序。CRISPR/Cas 9载体的酶切与测序结果均正确，表明载体构建成功；PCR鉴定结果显示，该系统对三种大肠杆菌均能进行aroA基因的有效敲除，敲除效率为46%~58%；测序结果进一步证实目的基因敲除成功。本试验成功构建大肠杆菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系统，为进一步研究致病菌aroA基因功能及开发减毒大肠杆菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。

Abstract:

CRISPR/Cas 9 system is a novel gene editing technology.This study was aimed to construct CRISPR/Cas 9-based knockout system for E.coli aroA gene，and analyze knockout efficiencies in different E.colis. In the present study，aroA gene-targeting short guide RNA (sgRNA) was designed and constructed together with Donor sequence for homologous repair，then this resulting vector and pEwt-Cas 9 vector co-constituted the CRISPR/Cas 9 system.Preliminary application was performed on E.coli DH10B，DH5α and JM109，respectively，and then knockout efficiencies of aroA gene were analyzed by PCR amplification，TA cloning and subsequent DNA sequencing.The restriction enzyme digestion analysis and sequencing results showed that homologous repair vector was successfully constructed.PCR results indicated that the established CRISPR/Cas 9 system could be used for aroA gene knockout in multiple E.coli with efficiency ranging from 46% to 50%.Sequencing results further confirmed the successful and accurate knockout of aroA gene.In conclusion，CRISPR/Cas 9-based knockout system for E.coli aroA gene was successfully established，which would provide a novel and effective tool for functional studies on aroA genes of other pathogenic microorganisms and further development of attenuated vaccine.

中图分类号:

S852.612

余深翼，赵金荣，郑玲红，朱二鹏，周五朵，吴宝成. 利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(4): 762-770.

YU Shen-yi，ZHAO Jin-rong，ZHENG Ling-hong，ZHU Er-peng，ZHOU Wu-duo，WU Bao-cheng. The Application of CRISPR/Cas 9 Technology for aroA Gene Knockout in Escherichia coli[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2016, 47(4): 762-770.

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The Application of CRISPR/Cas 9 Technology for aroA Gene Knockout in Escherichia coli

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