鸽圆环病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2025.01.031

畜牧兽医学报 ›› 2025, Vol. 56 ›› Issue (1): 335-342.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2025.01.031

鸽圆环病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

王星月¹(), 杨志远²(), 林健², 张紫萱¹, 周雨婷¹, 程慧敏², 刘月焕², 胡格¹^,*()

1. 北京农学院动物科学技术学院, 北京 102206
2. 北京市农林科学院畜牧兽医研究所, 北京 100097

收稿日期:2024-02-27 出版日期:2025-01-23 发布日期:2025-01-18
通讯作者: 胡格 E-mail:idwxy99@163.com;yangzy88@126.com;bnhuge@126.com
作者简介:王星月(1999-)，女，北京人，硕士生，主要从事畜禽疫病诊断与防治研究，E-mail：idwxy99@163.com
杨志远(1988-)，男，山西忻州人，副研究员，主要从事畜禽疫病诊断与防治研究，E-mail：yangzy88@126.com
第一联系人：
王星月和杨志远是同等贡献作者
基金资助:
现代农业产业技术体系北京市家禽创新团队(BAIC06-2024)；北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX20220422)

Development and Application of a Real-time Fluorescence Quantitative PCR Detection Method for Pigeon Circovirus

WANG Xingyue¹(), YANG Zhiyuan²(), LIN Jian², ZHANG Zixuan¹, ZHOU Yuting¹, CHENG Huimin², LIU Yuehuan², HU Ge¹^,*()

1. College of Animal Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China
2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097, China

Received:2024-02-27 Online:2025-01-23 Published:2025-01-18
Contact: HU Ge E-mail:idwxy99@163.com;yangzy88@126.com;bnhuge@126.com

摘要/Abstract

摘要：

为实现对鸽圆环病毒(pigeon circovirus，PiCV)的快速检测，建立了针对Cap基因的PiCV荧光定量PCR检测方法，并应用该方法进行PiCV分子流行病学调查。本研究针对PiCV核衣壳蛋白Cap基因的保守序列设计一对特异性引物，并通过优化反应条件，成功建立了荧光定量PCR检测方法。此外，还对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行了全面评估。利用建立的荧光定量PCR方法对华北和西北部分地区147份临床样本进行检测，并对阳性代表样本的Cap全长序列进行遗传演化分析。结果表明，所建立的荧光定量PCR方法在1×10⁴至1×10⁸拷贝·μL^-1范围内显示出良好的线性关系，最低检测限达到1×10¹拷贝·μL^-1，显著高于传统PCR方法。此方法具有良好的重复性，且不与其他常见鸽病病原产生交叉反应。采用本试验方法检测的147份华北和西北部分地区肉鸽和信鸽临床样本PiCV阳性率为85.0%，阳性样本的Cap全长序列分析及遗传演化分析结果显示，6株分离株相似性在89.8%~97.5%之间，与PiCV HeBeiTS2021株在同一个分支，亲缘关系较近。建立的PiCV荧光定量PCR方法具备灵敏、特异和稳定等优点，可用于PiCV的快速检测，同时流行病学调查结果表明，2022—2023年华北和西北部分地区PiCV感染率较高，为我国PiCV的防控研究提供数据支撑。

关键词: 鸽圆环病毒, Cap基因, 荧光定量PCR, 分子流行病学, 遗传演化分析

Abstract:

The aim of this study was to establish a rapid diagnostic method of pigeon circovirus (PiCV), a real-time quantitative PCR based on Cap gene was established and a molecular epidemiological investigation on PiCV was conducted. Specific primers targeting the conserved sequence of the Cap gene of PiCV were designed and synthesized. The sensitivity, specificity, and repeatability of the developed quantitative PCR method (qPCR) were evaluated. One hundred and forty-seven clinical samples from Northern and Northwest China were detected by the qPCR, followed by genome sequencing and phylogenetic analysis on whole length of Cap gene of isolates from different regions. The established qPCR method showed a good linear response for PiCV standards ranging from 1×10⁴ to 1×10⁸ copies·μL^-1, with a minimum detection limit as low as 1×10¹ copies·μL^-1, substantially surpassing conventional PCR. The intra-assay and inter-assay demonstrated a good repeatability. Importantly, there was no cross-reactivity with other pigeon pathogens. Detection results of 147 clinical samples collected from Northern and Northwest China by this method showed that the positive rate for PiCV was 85.0%. Sequencing results and phylogenetic analysis revealed that Cap gene of six isolates shared homology within the range of 89.8% to 97.5%, and were closely related to PiCV HeBeiTS2021 isolate. The established real-time quantitative PCR method for PiCV demonstrated sensitivity, specificity and repeatability, making it available for rapid detection of PiCV. Epidemiological investigation results indicated a higher PiCV infection rate in Northern and Northwest China during 2022-2023, providing valuable data for prevention and control of PiCV.

Key words: pigeon circovirus, Cap gene, real-time fluorescence quantitative PCR, molecular epidemiology, phylogenetic analysis

中图分类号:

S852.659.2

王星月, 杨志远, 林健, 张紫萱, 周雨婷, 程慧敏, 刘月焕, 胡格. 鸽圆环病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J]. 畜牧兽医学报, 2025, 56(1): 335-342.

WANG Xingyue, YANG Zhiyuan, LIN Jian, ZHANG Zixuan, ZHOU Yuting, CHENG Huimin, LIU Yuehuan, HU Ge. Development and Application of a Real-time Fluorescence Quantitative PCR Detection Method for Pigeon Circovirus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2025, 56(1): 335-342.

图/表 6

表 1

表 2

图 1

表 3

表 4

图 2

参考文献 23

1	SANTOS H M , TSAI C Y , CATULIN G E M , et al. Common bacterial, viral, and parasitic diseases in pigeons (Columba livia): a review of diagnostic and treatment strategies[J]. Vet Microbiol, 2020, 247, 108779. doi: 10.1016/j.vetmic.2020.108779
2	WOODS L W , LATIMER K S , NIAGRO F D , et al. A retrospective study of circovirus infection in pigeons: nine cases (1986-1993)[J]. J Vet Diagn Invest, 1994, 6 (2): 156- 164. doi: 10.1177/104063879400600205
3	ABADIE J , NGUYEN F , GROIZELEAU C , et al. Pigeon circovirus infection: pathological observations and suggested pathogenesis[J]. Avian Pathol, 2001, 30 (2): 149- 158. doi: 10.1080/03079450124811
4	王浩然. 鸽圆环病毒分子流行病学调查及检测方法的建立[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2021.
	WANG H R. Molecular epidemiological investigation and establishment of diagnostic technique on pigeon circovirus[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2021. (in Chinese)
5	WANG H R , GAO H , JIANG Z W , et al. Molecular detection and phylogenetic analysis of pigeon circovirus from racing pigeons in Northern China[J]. BMC Genomics, 2022, 23 (1): 290. doi: 10.1186/s12864-022-08425-8
6	TODD D . Avian circovirus diseases: lessons for the study of PMWS[J]. Vet Microbiol, 2004, 98 (2): 169- 174. doi: 10.1016/j.vetmic.2003.10.010
7	李晓波, 王吉, 王莎莎, 等. 鸽圆环病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J]. 实验动物科学, 2022, 39 (4): 28- 32. doi: 10.3969/j.issn.1006-6179.2022.04.006
	LI X B , WANG J , WANG S S , et al. Establishment and application of fluorescent quantitative PCR assay for pigeon circovirus[J]. Laboratory Animal Science, 2022, 39 (4): 28- 32. doi: 10.3969/j.issn.1006-6179.2022.04.006
8	日孜瓦古·努尔东, 米晓云, 魏玉荣, 等. 鸽圆环病毒Cap及Rep基因的克隆与进化分析[J]. 塔里木大学学报, 2020, 32 (1): 1- 6. doi: 10.3969/j.issn.1009-0568.2020.01.001
	RIZIWAGU·NUERDONG , MI X Y , WEI Y R , et al. Cloning and phylogenetic analysis of Cap and Rep genes of pigeon circovirus[J]. Journal of Tarim University, 2020, 32 (1): 1- 6. doi: 10.3969/j.issn.1009-0568.2020.01.001
9	SILVA B B I , URZO M L R , ENCABO J R , et al. Pigeon circovirus over three decades of research: bibliometrics, scoping review, and perspectives[J]. Viruses, 2022, 14 (7): 1498. doi: 10.3390/v14071498
10	ZHANG Z C , DAI W , WANG S H , et al. Epidemiology and genetic characteristics of pigeon circovirus (PiCV) in eastern China[J]. Arch Virol, 2015, 160 (1): 199- 206. doi: 10.1007/s00705-014-2255-4
11	韩晓语, 杨俊杰, 赵洪哲, 等. 鸽圆环病毒Cap基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的建立及应用[J]. 中国动物传染病学报, 2024, 32 (3): 95- 101.
	HAN X Y , YANG J J , ZHAO H Z , et al. Development and application of SYBR green Ⅰ fluorescent quantitative PCR for detection of Cap Gene of pigeon circovirus[J]. Chinese Journal of Veterinary Parasitology, 2024, 32 (3): 95- 101.
12	栗文文, 袁海霞, 徐雅萍, 等. 鸽圆环病毒研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38 (8): 236- 238.
	LI W W , YUAN H X , XU Y P , et al. Pigeon circovirus research progress[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2011, 38 (8): 236- 238.
13	NATH B K , DAS S , DAS T , et al. Development and applications of a TaqMan based quantitative real-time PCR for the rapid detection of Pigeon circovirus (PiCV)[J]. J Virol Methods, 2022, 308, 114588. doi: 10.1016/j.jviromet.2022.114588
14	MANKERTZ A , HATTERMANN K , EHLERS B , et al. Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons[J]. Arch Virol, 2000, 145 (12): 2469- 2479. doi: 10.1007/s007050070002
15	兰世捷, 苗艳, 陈亮, 等. 鸽圆环病毒和鸽疱疹病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 中国家禽, 2022, 44 (4): 113- 116.
	LAN S J , MIAO Y , CHEN L , et al. Establishment and preliminary application of double PCR detection method for pigeon circovirus and pigeon herpesvirus[J]. China Poultry, 2022, 44 (4): 113- 116.
16	HATTERMANN K , SOIKE D , GRUND C , et al. A method to diagnose Pigeon circovirus infection in vivo[J]. J Virol Methods, 2002, 104 (1): 55- 58. doi: 10.1016/S0166-0934(02)00038-1
17	亓玉卓, 梁琳, 朱亚丽, 等. 鸽圆环病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用[J]. 中国家禽, 2021, 43 (3): 22- 27.
	QI Y Z , LIANG L , ZHU Y L , et al. Development and application of SYBR green Ⅰ real-time PCR for detection of pigeon circovirus[J]. China Poultry, 2021, 43 (3): 22- 27.
18	郭学波, 赵承锋, 吴瑶, 等. 鸽圆环病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 中国兽医科学, 2024, 54 (2): 169- 173.
	GUO X B , ZHAO C F , WU Y , et al. Establishment and application of PCR assay for detect of pigeon circovirus[J]. Chinese Veterinary Science, 2024, 54 (2): 169- 173.
19	ZHANG Z C , LU C P , WANG Y , et al. Molecular characterization and epidemiological investigation of Pigeon circovirus isolated in eastern China[J]. J Vet Diagn Invest, 2011, 23 (4): 665- 672. doi: 10.1177/1040638711407878
20	SAHINDOKUYUCU I , YAZICI Z , BARRY G . A retrospective molecular investigation of selected pigeon viruses between 2018-2021 in Turkey[J]. PLoS One, 2022, 17 (8): e0268052. doi: 10.1371/journal.pone.0268052
21	NATH B K , DAS S , TIDD N , et al. Lesions and viral loads in racing pigeons naturally coinfected with pigeon circovirus and columbid alphaherpesvirus 1 in Australia[J]. J Vet Diagn Invest, 2023, 35 (3): 278- 283. doi: 10.1177/10406387231156839
22	STENZEL T A , PESTKA D , TYKAŁOWSKI B , et al. Epidemiological investigation of selected pigeon viral infections in Poland[J]. Vet Rec, 2012, 171 (22): 562. doi: 10.1136/vr.100932
23	CSÁGOLA A , LŐRINCZ M , TOMBÁCZ K , et al. Genetic diversity of pigeon circovirus in Hungary[J]. Virus Genes, 2012, 44 (1): 75- 79.

引物名称 Primers	引物序列(5'→3') Primer sequences (5'→3')	产物大小/bp Product size (bp)
CV-F	$\underline{{\rm{GAATT}}}$CAGTAGGTAACCTCACACTCA	530
CV-R	$\underline{{\rm{AAGCTT}}}$GATAACCTTGCCAACGAATG	530
qCap-F	GGTTGCTGCTGTCTGGTTTG	158
qCap-R	AGACCTTCCAGCAAGTGACG	158
Cap-F	GCGAAGCGACTACACTCGAA	911
Cap-R	ACTAATCCGCGACTTGGAGC	911

登录号 Accession No.	分离国家 Country	宿主 Host	提交年份 Year	长度/nt Length/nt	Cap基因位置 Position of Cap gene
AF252610.1	德国	鸽	2000	2 037	1 166-1 987
NC-002361.1	德国	鸽	2000	2 037	1 166-1 987
AJ298229	英国	鸽	2001	2 037	1 166-1 987
DQ915960	法国	鸽	2006	2 037	1 166-1 987
DQ915956	比利时	鸽	2006	2 038	1 167-1 988
DQ915961.1	美国	鸽	2006	2 037	1 166-1 987
EU840176	美国	鸽	2008	2 041	1 167-1 988
KF738870.1	波兰	鸽	2013	2 037	1 166-1 987
LC035390.1	日本	鸽	2015	2 041	1 166-1 987
KX108803.1	中国	鸽	2016	2 037	1 166-1 987
KX108815.1	中国	鸽	2016	2 037	1 166-1 987
KX108817.1	中国	鸽	2016	2 031	1 166-1 981
KY114965.1	巴西	鸽	2016	2 041	1 167-1 991
KX431143	中国	鸽	2016	2 034	1 165-1 980
MF136692.1	澳大利亚	鸽	2017	2 037	1 166-1 987
MF621931.1	巴西	鸽	2017	2 038	1 120-1 941
MW181957.1	中国	鸽	2020	2 042	1 166-1 987
MW656169.1	波兰	鸽	2021	2 043	1 174-1 995
OL901206.1	中国	鸽	2021	2 037	1 166-1 987
ON598390.1	中国	鸽	2022	2 032	1 166-1 978
OQ184742.1	中国	鸽	2023	2 037	1 166-1 987
OR573846.1	中国	鸽	2023	2 036	1 165-1 986
OR611917.1	中国	鸽	2023	2 037	1 165-1 983
HQ738642	尼日利亚	鸡	2010	2 036	1 125-1 946
OK094643.1	中国	鸭	2021	1 994	1 157-1 930
OQ744003.1	泰国	鸭	2023	1 996	1 160-1 933
MN171332.1	中国	鹅	2018	1 822	1 009-1 761
MN420497.1	中国	鸡	2019	2 001	1 135-2 001

地区 Sampling area	鸽 Pigeon	采样场点数 Site	采样时间(月/年) Date	样本数量 Numbers	PCR(阳性/样品) PCR (Positive/total)	qPCR(阳性/样品) qPCR (Positive/total)
北京市	肉鸽	1	11/2022	35	29/35	33/35
北京市	信鸽	2	06/2023	20	2/20	2/20
山西省	信鸽	1	07/2023	9	9/9	9/9
河北省	信鸽	1	10/2022	64	44/64	62/64
陕西省	信鸽	1	06/2023	7	4/7	7/7
新疆	信鸽	1	10/2022	2	1/2	2/2
内蒙古	信鸽	2	08/2023	6	6/6	6/6
甘肃省	信鸽	1	07/2023	4	3/4	4/4
总计	-	10	-	147	98/147	125/147

常规PCR PCR	荧光定量PCR qPCR
常规PCR PCR	阳性Positive	阴性Negative
阳性Positive	98	0
阴性Negative	27	22

[1]	高一鸣, 陈国盛, 倪诗婷, 佟泽, 王豪男, 杨钒, 杨丽君, 莫玉鹏, 谭臣. 2022年中国南方部分地区猪肺炎支原体感染状况的调查与分析[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(7): 3064-3074.
[2]	江锦秀, 张靖鹏, 林裕胜, 刘维巍, 胡奇林, 万春和. 基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体TaqMan检测方法的建立及其遗传演化分析[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(4): 1684-1695.
[3]	马春玲, 任善会, 杨雪, 蔺玉刚, 李积雲, 王相伟, 殷相平, 孙跃峰, 万学瑞, 陈豪泰. 基于牛结节性皮肤病病毒ORF61基因荧光定量检测方法的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(4): 1800-1809.
[4]	董欣怡, 李锦群, 陈钦玺, 廖明, 曹伟胜. J亚群禽白血病病毒血液核酸筛查技术的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(3): 1115-1126.
[5]	冯琦, 刘义钢, 何琴, 李泽龙, 马英才, 易鹏飞, 李娜, 孙亚伟, 陈如龙, 姚刚, 马雪连. 大青叶水提物对牛传染性鼻气管炎病毒的体外增殖抑制活性评价[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(11): 5287-5298.
[6]	欧兰欣, 叶碧锦, 孙铭飞, 戚南山, 李娟, 吕敏娜, 林栩慧, 蔡海明, 胡俊菁, 宋勇乐, 陈祥杰, 朱易斌, 尹理君, 张健騑, 廖申权, 张浩吉. 产气荚膜梭菌四环素耐药基因双重荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(10): 4630-4637.
[7]	张红强, 任善会, 姚威, 龚真莉, 杨雪, 马春玲, 尤婷, 张玉哲, 柳民意, 钱文洁, 李柳杨, 余志鹏, 孙跃峰, 陈豪泰, 樊江峰. 靶向山羊痘病毒GPCR基因SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(10): 4779-4784.
[8]	常益铭, 汤承, 岳华. 牦牛源牛呼吸道合胞体病毒的分子流行病学调查[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(5): 2030-2041.
[9]	何姝凡, 邹沅彤, 黄智兰, 李倩, 降措翁西, 岳华, 汤承, 刘杰. 牛腺病毒3型感染状况及其fiber轴区基因检测[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(3): 1333-1340.
[10]	王梦娇, 蒋倩, 马学军, 夏瑞阳, 郭雪萍, 孙磊, 钟旗, 马雪连, 姚刚. 新疆地区牛冠状病毒的分子流行病学调查[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 5125-5133.
[11]	邹宏, 夏应菊, 李玲, 徐璐, 赵俊杰, 王团结, 张乾义, 宋振辉. 猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(10): 4422-4427.
[12]	常昊, 邱英武, 彭杰, 高琦, 宋泽布, 陈洋, 李薇, 林丽苗, 曹雪珍, 周庆丰, 张桂红, 李群辉, 郑泽中. 非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型的双重实时荧光定量PCR检测方法建立[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(10): 4428-4432.
[13]	龚三你, 蒋旭东, 马瑶, 卢建远, 字向东. 牦牛FHL2基因的克隆、组织表达与蛋白定位分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(1): 146-156.
[14]	何庆, 李周勉, 王欢, 李丹彤, 谭庆辉, 邹亚文, 苏建明, 邓治邦, 杨毅, 王乃东. 猪流产胎儿中猪圆环病毒3型的检测及其遗传演化分析[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(5): 1527-1535.
[15]	王华健, 张宁, 杨威, 赵志强, 李茜, 陆安, 田勇, 何欣, 赵兴华, 李杰峰. 3种食源性致病菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(4): 1201-1209.

鸽圆环病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

Development and Application of a Real-time Fluorescence Quantitative PCR Detection Method for Pigeon Circovirus

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表 6

参考文献 23

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价