犬瘟热病毒囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及鉴定

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.014

畜牧兽医学报 ›› 2015, Vol. 46 ›› Issue (6): 981-988.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.014

犬瘟热病毒囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及鉴定

虞一聪^1，2，冯娜^2，3*，闫飞虎²，盖微微²，王铁成²，王化磊^2，3，郑学星^2，3，赵永坤^2，3，黄耕²，杨松涛²，高玉伟²，夏咸柱^2，3，4*

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春 130122；3.中国农业科学院长春兽医研究所，长春 130122；4.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）

收稿日期:2014-09-28 出版日期:2015-06-23 发布日期:2015-06-19
通讯作者: 夏咸柱，E-mail：xiaxzh@cae.cn；冯娜，E-mail：fengna0308@126.com
作者简介:虞一聪（1989-），男，浙江慈溪人，硕士生，主要从事动物分子病毒学研究，E-mail：jordanyuyicong@163.com
基金资助:
国家公益性行业（农业）科研专项（201303042）

Expression and Identification of Glycoprotein of Canine Distemper Virus in the Baculovirus-Insect Cell System

YU Yi-cong^1，2，FENG Na^2，3* ，YAN Fei-hu²，GAI Wei-wei²，WANG Tie-cheng²，WANG Hua-lei^2，3，ZHENG Xue-xing^2，3，ZHAO Yong-kun^2，3，HUANG Geng²，YANG Song-tao²，GAO Yu-wei²，XIA Xian-zhu^2，3，4*

（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Jilin Province，Military Veterinary Institute of the Academy of Military Medical Sciences，Changchun 130122，China；3.Changchun Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130122，China；4.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonosis，Yangzhou 225009，China）

Received:2014-09-28 Online:2015-06-23 Published:2015-06-19

摘要/Abstract

摘要：

为表达具有天然构象的犬瘟热病毒（CDV）囊膜糖蛋白融合蛋白（F）和血凝素蛋白（H），本研究扩增小熊猫源CDV驯化致弱株LP的F、H基因，克隆至pFastBac^TM1载体中，测序验证后转化至DH10Bac^TM感受态细胞，同源重组获得穿梭质粒rBacmid-F、rBacmid-H，将其分别转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB-F、rpFB-H，并将表达的重组融合蛋白（rF）和血凝素蛋白（rH）进行IFA和Western blot鉴定。以犬抗CDV高免血清对重组杆状病毒感染细胞进行IFA鉴定，在感染细胞的细胞膜上可见特异性荧光反应；以鼠抗F、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体对重组杆状病毒感染细胞进行Western blot检测，可见相对分子质量为63和68 ku左右的条带，分别为重组融合蛋白（rF）和血凝素蛋白（rH），大小与预期相符。两种囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中均成功表达，且具有良好的反应原性。本研究为CDV病毒样颗粒疫苗的开发等工作奠定了基础。

关键词: 犬瘟热病毒, 融合蛋白, 血凝素蛋白, 杆状病毒-昆虫细胞系统

Abstract:

The objectives of this study were to express the native structure of fusion protein (F) and hemagglutinin glycoprotein (H) of canine distemper virus (CDV).The F and H gene of lesser panda attenuated strain were amplified by PCR and cloned into pFastBac^TM1 vector.The recombinant plasmids were sequenced，and then were transformed into competent DH10Bac^TM E.coli cells to construct shuttle plasmids，rBacmid F and rBacmid H，by homologous recombination.The recombinant plasmids were then transfected into Sf9 cells to construct recombinant baculoviruses and the expression products of rF and rH were identified with IFA and Western blot.The expression of rF and rH in insect cells infected with recombinant baculoviruses were identified by IFA with dog anti-CDV hyperimmune serum and were detected by Western blot with mouse polyclonal antibody against F and H major epitopes of CDV.The molecular weight of expressed F and H protein were identified as 63 and 68 kD，which were consistent with the expected value.The results show that both envelope glycoproteins are successfully expressed in baculovirus-insect cell expression system and have a good immunoreactivity.Our study laid the foundation for the development of the CDV virus-like particle vaccine.

Key words: canine distemper virus, fusion protein, attachment glycoprotein, baculovirus-insect cell system

中图分类号:

S852.659.5

虞一聪，冯娜，闫飞虎，盖微微，王铁成，王化磊，郑学星，赵永坤，黄耕，杨松涛，高玉伟，夏咸柱. 犬瘟热病毒囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(6): 981-988.

YU Yi-cong，FENG Na，YAN Fei-hu，GAI Wei-wei，WANG Tie-cheng，WANG Hua-lei，ZHENG Xue-xing，ZHAO Yong-kun，HUANG Geng，YANG Song-tao，GAO Yu-wei，XIA Xian-zhu. Expression and Identification of Glycoprotein of Canine Distemper Virus in the Baculovirus-Insect Cell System[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2015, 46(6): 981-988.

参考文献

［1］WANG F，YAN X，CHAI X，et al.Differentiation of canine distemper virus isolates in fur animals from various vaccine strains by reverse transcription-polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism according to phylogenetic relations in China［J］.Virol J，2011，8：85.
［2］蔡宝祥.家畜传染病学［M］.2版.北京：中国农业出版社，1999：301-304.
CAI B X.Livestock infectious disease ［M］.2ed edition.Beijing：China Agriculture Press，1999：301-304.(in Chinese)
［3］APPEL M J G，MONTALI R J.Canine distemper and emerging morbillivirus diseases in exotic species［C］.Proc Am Assoc Zoo Vet，1994：336-339.
［4］李金中，夏咸柱，邱薇，等.小熊猫等四种动物犬瘟热病毒的分离与鉴定［J］.中国兽医科技，1998，28(8)：8-10.
LI J Z，XIA X Z,QIU W,et al.Isolation and identification of canine distemper virus from lesser panda，dog，raccoon dog and fox［J］.Chinese Journal of Veterinary Science and Technology，1998，28(8)：8-10.(in Chinese)
［5］胡桂学，夏咸柱，李金中.大熊猫犬瘟热致死性感染的首次报告［C］.中国微生物学会兽医微生物学学术年会论文集.北京，1997，1(997)：1.
HU G X，XIA X Z，LI J Z.The first report of giant panda infected with lethal canine distemper［C］.Chinese Society for Microbiology Veterinary Microbiology Academic Conference.Beijing，1997，1(997)：1.(in Chinese)
［6］QIU W，ZHENG Y，ZHANG S，et al.Canine distemper outbreak in rhesus monkeys，China［J］.Emerg Infect Dis，2011，17(8)：1541-1543.
［7］NORRIS J M，KROCKENBERGER M B，BAIRD A A，et al.Canine distemper：re-emergence of an old enemy［J］.Aust Vet J，2006，84(10)：362-363.
［8］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京：科学出版社，1997：756-762.
YIN Z，LIU J H.Animal virology［M］.2ed edition.Beijing：Science Press，1997：756-762.(in Chinese)
［9］VON MESSLING V，ZIMMER G，HERRLER G，et al.The hemagglutinin of canine distemper virus determines tropism and cytopathogenicity［J］.J Virol，2001，75(14)：6418-6427.
［10］潘耀谦.犬瘟热发病机理的免疫及分子病理学研究——脑组织及淋巴器官病变观察［D］.北京：中国农业大学，2005.
PAN Y Q.Studies of pathogenesis of immune and molecular pathology on dogs with canine distemper—pathologic observation in brain tissues and lymphatic tissues［D］.Beijing：China Agricultural University，2005.(in Chinese)
［11］萨姆布鲁克 J，弗里奇 E F，曼尼阿蒂斯 T.分子克隆实验指南［M］.2版.北京：科学出版社，1993：674-683.
SAMBMOK J，FRITSEH E F，MANIATIS T.Molecular cloning a laboratory manual［M］.2ed edition.Beijing：Science Press，1993：674-683.(in Chinese)
［12］DEEM S L，SPELMAN L H，YATES R A，et al.Canine distemper in terrestrial carnivores：a review［J］.J Zoo Wildl Med，2000，31(4)：441-451.
［13］MARTELLA V，ELIA G，BUONAVOGLIA C.Canine distemper virus［J］.Vet Clin North Am Small Anim Pract，2008，38(4)：787-797.
［14］孔庆波.犬瘟热免疫预防研究进展［J］.动物医学进展，2007，28(6)：69-75.
KONG Q B.Progress on immune prevention of canine distemper［J］.Progress in Veterinary Medicine，2007，28(6)：69-75.(in Chinese)
［15］BARRETT T.Morbillivirus infections，with special emphasis on morbilliviruses of carnivores［J］.Vet Microbiol，1999，69(1-2)：3-13.
［16］王磊，李天松，刘玉秀，等.犬瘟热新型疫苗研究进展［J］.动物医学进展，2011，32(3)：99-103.
WANG L，LI T S，LIU Y X，et al.Progress on new type vaccines of canine distemper［J］.Progress in Veterinary Medicine，2011，32(3)：99-103.(in Chinese)
［17］WELTER J，TAYLOR J，TARTAGLIA J，et al.Vaccination against canine distemper virus infection in infant ferrets with and without maternal antibody protection，using recombinant attenuated poxvirus vaccines［J］.J Virol，2000，74(14)：6358-6367.
［18］高炳淼，李宝珠，于津鹏，等.外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达［J］.中国生物工程杂志，2011，31(11)：123-129.
GAO B M，LI B Z，YU J P，et al.Expression of foreign genes in insect baculovirus expression systems［J］. China Biotechnology，2011，31(11)：123-129.(in Chinese)
［19］AILOR E，BETENBAUGH M J.Modifying secretion and post-translational processing in insect cells［J］.Curr Opin Biotechnol，1999，10(2)：142-145.
［20］DAI X，HAJÓS J P，JOOSTEN N N，et al.Isolation of a Spodoptera exigua baculovirus recombinant with a 10.6 kbp genome deletion that retains biological activity［J］.J Gen Virol，2000，81(10)：2545-2554.
［21］SANDOVAL C，CURTIS H，CONGOTE L F.Enhanced proliferative effects of a baculovirus-produced fusion protein of insulin-like growth factor and α1-proteinase inhibitor and improved anti-elastase activity of the inhibitor with glutamate at position 351［J］.Protein Eng，2002，15(5)：413-418.
［22］FRAZER I H.Cervical cancer vaccine development［J］.Sex Health，2010，7(3)：230-234.
［23］MENA J A，KAMEN A A.Insect cell technology is a versatile and robust vaccine manufacturing platform［J］.Expert Rev Vaccines，2011，10(7)：1063-1081.
［24］全传松，姜骞，于作，等.犬瘟热病毒血凝蛋白在昆虫细胞中的表达与抗原性分析［J］.中国畜牧兽医，2014，41(8)：25-29.
QUAN C S，JIANG Q，YU Z，et al.Expression of hemagglutinin of canine distemper virus in the insect cell and its antigenic analysis［J］.China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，2014，41(8)：25-29.(in Chinese)
［25］隋修锟，金红岩，李文超，等.小反刍兽疫病毒H基因在杆状病毒中的表达及其免疫原性研究［J］.畜牧兽医学报，2014，45(6)：974-980.
SUI X K，JIN H Y，LI W C，et al.Expression of H gene of Peste des Petits Ruminants virus in baculovirus and its immunogenicity study［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2014，45(6)：974-980.(in Chinese)
［26］冯佩平.犬瘟热病毒主要结构蛋白基因在昆虫细胞中的表达及间接 ELISA 检测方法的建立［D］.长春：吉林农业大学，2012.
FENG P P.Expression of CDV major structural protein in Sf9 cells and establishment of indirect ELISA assay［D］.Changchun：Jilin Agricultural University，2012.(in Chinese)
［27］刘拂晓.小反刍兽疫病毒样颗粒的构建及对小鼠免疫效力的评价［D］.长春：吉林大学，2013.
LIU F X.Construction of Peste des Petits Ruminants virus-like particles and evaluation of their immune effects in mice［D］.Changchun：Jilin University，2013.(in Chinese)
［28］LI W，JIN H，SUI X，et al.Self-assembly and release of peste des petits ruminants virus-like particles in an insect cell-baculovirus system and their immunogenicity in mice and goats［J］.PLoS One，2014，9(8)：e104791.

[1]	朱璐, 燕霞, 代科, 王正皓, 赵玉佳, 杨振, 文心田, 曹三杰, 黄小波, 伍锐, 赵勤, 文翼平. 稳定表达SLAM受体的Vero和BHK21细胞系的建立及其对犬瘟热病毒分离效果的比较[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(6): 1212-1221.
[2]	朱璐, 燕霞, 代科, 王正皓, 赵玉佳, 杨振, 文心田, 曹三杰, 黄小波, 伍锐, 赵勤, 文翼平. 稳定表达SLAM受体的Vero和BHK21细胞系的建立及其对犬瘟热病毒分离效果的比较[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(6): 1212-1221.
[3]	谢建山，张丹瑾，郭艳妮，范瑞文，许冬梅，杨玉静，聂瑞强，于秀菊，段力升，朱芷葳，高文俊，赫晓燕，董常生. 突触融合蛋白4在不同毛色小鼠皮肤组织的差异表达[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(6): 957-964.
[4]	虞一聪，冯娜，闫飞虎，盖微微，王铁成，王化磊，郑学星，赵永坤，黄耕，杨松涛，高玉伟，夏咸柱. 犬瘟热病毒囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(6): 981-988.
[5]	谢建山，张丹瑾，郭艳妮，范瑞文，许冬梅，杨玉静，聂瑞强，于秀菊，段力升，朱芷葳，高文俊，赫晓燕，董常生. 突触融合蛋白4在不同毛色小鼠皮肤组织的差异表达[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(6): 957-964.
[6]	蒙学莲,窦永喜,朱学亮,骆学农,才学鹏. 小反刍兽疫病毒血凝素蛋白与受体蛋白SLAM的相互作用[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(3): 426-433.
[7]	黄蓉，梁威，刘纪园，王爱荣，柴同杰. H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析及其对小鼠致病力的研究[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(3): 443-450.
[8]	蒙学莲,窦永喜,朱学亮,骆学农,才学鹏. 小反刍兽疫病毒血凝素蛋白与受体蛋白SLAM的相互作用[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(3): 426-433.
[9]	黄蓉，梁威，刘纪园，王爱荣，柴同杰. H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析及其对小鼠致病力的研究[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(3): 443-450.
[10]	黄娟，王聪，张洪亮，单虎. 水貂犬瘟热病毒受体——信号淋巴细胞激活因子的细胞定位及组织分布[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(2): 289-294.
[11]	黄娟，王聪，张洪亮，单虎. 水貂犬瘟热病毒受体——信号淋巴细胞激活因子的细胞定位及组织分布[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(2): 289-294.
[12]	高云欢，李娜，董昌海，唐然肖，李丽敏，王家鑫. 清道夫受体在树突状细胞提呈口蹄疫病毒VP1-VP4抗原中的作用[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(1): 129-135.
[13]	高云欢，李娜，董昌海，唐然肖，李丽敏，王家鑫. 清道夫受体在树突状细胞提呈口蹄疫病毒VP1-VP4抗原中的作用[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(1): 129-135.
[14]	丁轲，余祖华，李旺，闫文朝，王臣，赵战勤，程相朝，张春杰，王天奇，程安春，汪铭书. 共表达鹅细小病毒VP3-gIL2重组乳酸杆菌的构建及其口服免疫评价[J]. 畜牧兽医学报, 2013, 44(2): 262-269.
[15]	丁轲，余祖华，李旺，闫文朝，王臣，赵战勤，程相朝，张春杰，王天奇，程安春，汪铭书. 共表达鹅细小病毒VP3-gIL2重组乳酸杆菌的构建及其口服免疫评价[J]. 畜牧兽医学报, 2013, 44(2): 262-269.

犬瘟热病毒囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及鉴定

Expression and Identification of Glycoprotein of Canine Distemper Virus in the Baculovirus-Insect Cell System

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