禽痘病毒微滴数字PCR检测方法的建立及应用

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2026.01.029

摘要/Abstract

摘要：

旨在建立一种禽痘病毒（fowlpox virus，FWPV）微滴式数字聚合酶链式反应（digital droplet PCR，ddPCR）检测方法。本研究通过对反应体系优化，包括引物和探针浓度的优化、退火温度的优化等步骤，进行重复性、敏感性、特异性试验，建立了较为完整的ddPCR反应体系。本方法确定FWPV ddPCR反应体系最佳引物浓度为900 nmol·L^-1，最佳探针浓度为200 nmol·L^-1，且在55 ℃反应条件下，ddPCR检测结果最优；本方法与其他常见禽类病毒无交叉反应，特异性强；本方法重复性好，批间与批内变异系数均小于10%。本ddPCR方法最低检测限为2.37拷贝·反应^-1。采用建立的ddPCR检测方法和行业标准（SN/T 1226—2015）检测方法对80份模拟样本进行检测，其中8份作为阴性，其余72份样品作为模拟感染样品，符合率为100%，比行业标准套式PCR方法符合率高出75%。在25份人工攻毒样本中，ddPCR对阳性样本的检出率达100%，行业标准套式PCR方法对阳性样本的检出率为33.3%。本方法的建立为检测禽及其肉制品中禽痘病毒提供了痕量精准检测方法，为降低禽痘对禽类养殖产业风险带来保障。

关键词: 禽痘病毒, 微滴数字PCR, 定量检测

Abstract:

A microdroplet digital polymerase chain reaction （ddPCR） method for the detection of fowlpox virus （FWPV） was established. In this study， a more complete ddPCR reaction system was established through the optimization of the reaction system， including the optimization of primer and probe concentrations， the optimization of annealing temperature and other steps， and reproducibility， sensitivity， and specificity experiments. In this method， the optimal primer concentration was determined to be 900 nmol·L^-1， the optimal probe concentration was 200 nmol·L^-1， and the results of ddPCR were optimized under the reaction condition of 55 ℃. The method showed no cross-reactivity with other common avian viruses and is highly specific. The reproducibility of the method is good， and the coefficients of variation between and within batches are less than 10%. The lowest detection limit of this ddPCR method was 2.37 copies per reaction. Using the established ddPCR detection method and the industry standard （SN/T 1226—2015） detection method for 80 samples， the coincidence rate was 100%， which was higher than the coincidence rate of 75% of the industry standard nested PCR method. In 25 artificially inoculated samples， the detection rate of ddPCR for positive samples reached 100%， while the detection rate of the nested PCR method specified in the industry standard for positive samples was 33.3%. The establishment of this method helps the relevant inspection and quarantine departments at ports to detect the FWPV in a timely manner and reduces the risk of the domestic poultry breeding industry by providing a more accurate and efficient detection method.

Key words: fowlpox virus, droplet digital PCR, quantitation assay

中图分类号:

S852.659.1

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图/表 10

表1

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参考文献 40

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引物/探针 Primer/probe	序列（5→3'） Sequence	位置 Position	长度/bp Product
FWPV-F	AGAAAACGAAGCGTCGCAATAGC	88 824—88 846	132
FWPV-R	ATTGTGGCCGCGCTTAACGGTG	88 715—88 736	132
FWPV-P	TTCACGCAAATAGCTGTCAAACTGG	88 797—88 821	/
FWPV-1	CAGCAGGTGCTAAACAACAA	201 978—201 997	558
FWPV-2	CGGTAGCTTAACGCCGAATA	201 420—201 439	558
FWPV-3	ACGACCTATGCGTCTTC	201 962—201 978	419
FWPV-4	ACGCTTGATATCTGGATG	201 560—201 577	419

质粒浓度/（拷贝·反应^-1） Plasmids concentration（copies per reaction）	微滴式数字PCR ddPCR
质粒浓度/（拷贝·反应^-1） Plasmids concentration（copies per reaction）	检测值（x±s）/（拷贝·反应^-1） Detected values （x±s）/（copies per reaction）	阳性/样本数 Positive/Reactions	相对标准偏差 RSD
10³	1 003.50 ±61.43	30/30	0.88%
10²	103.73±7.37	30/30	1.52%
10	9.80±1.53	30/30	6.80%
7.5	8.32±2.11	30/30	12.23%
5	5.83±1.37	30/30	14.02%
2.5	ND	29/30	/
1	ND	22/30	/

结果 Results	方法 Method
结果 Results	PCR （SN/T 1226—2015）	微滴式数字PCR ddPCR
阳性 Positive	18	72
阴性 Negative	62	8
总数 Total	80	80
符合率/% Compliance rate	25	100

检测部位 Detection site	检出阳性数 Number of positive
	攻毒组（n=3） Challenge group		阴性组（n=2） Negative group
	ddPCR	PCR	ddPCR	PCR
阳性检出率/% Positive detection rate	100（15/15）	33.3（5/15）	0（0/10）	0（0/10）
鸡冠 Cockscomb	3/3	3/3	0/2	0/2
鸡爪 Foot	3/3	2/3	0/2	0/2
肺 Lung	3/3	0/3	0/2	0/2
肾脏 Kidney	3/3	0/3	0/2	0/2
血液 Blood	3/3	0/3	0/2	0/2