畜牧兽医学报 ›› 2024, Vol. 55 ›› Issue (1): 413-418.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.01.040
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周建浩1, 王东方2, 刘影2, 王淑娟2, 马震原2, 谢彩华2, 赵雪丽2, 杨海波2, 冯桂丹4, 康台生3, 胡煜锋1, 李博文3, 闫若潜2*
ZHOU Jianhao1, WANG Dongfang2, LIU Ying2, WANG Shujuan2, MA Zhenyuan2, XIE Caihua2, ZHAO Xueli2, YANG Haibo2, FENG Guidan4, KANG Taisheng3, HU Yufeng1, LI Bowen3, YAN Ruoqian2*
摘要: 旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针;通过对反应体系和反应条件的优化,成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR)方法,将自行建立的FQ-PCR方法的引物对/探针用来确定ddPCR 方法;对ddPCR方法进行敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示:自行建立的FQ-PCR方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-PCR方法;根据自行设计的FQ-PCR方法建立的ddPCR方法最低检测极限为0.15 copies·μL-1,敏感性高于行业标准(SN/T 1699—2017)FQ-PCR方法(1.0×101 copies·μL-1);模板浓度为1.0×100~1.0×104 copies·μL-1时,具有良好的线性关系(R2>0.99);批内、批间变异系数(CV%)为1.52%~7.40%;对猪丁型冠状病毒、猪伪狂犬病毒等11种对照病毒核酸检测结果均为阴性;分别用建立的ddPCR方法、行业标准FQ-PCR方法对150份临床样品进行PEDV核酸检测,ddPCR方法对行业标准FQ-PCR方法检测阳性样品的检测符合率为100%。本研究成功建立的PEDV ddPCR检测方法可用于临床上PEDV感染的早期检测和定量检测,为PEDV核酸标准物质的研制提供了定量手段。
中图分类号: