帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2024.01.037

畜牧兽医学报 ›› 2024, Vol. 55 ›› Issue (1): 395-400.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.01.037

帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

杨恒^1,2, 李占鸿², 宋子昂³, 高林², 李卓然², 廖德芳², 肖雷^2*, 李华春^2*

1. 昆明学院农学与生命科学学院, 昆明 650214;
2. 云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室, 昆明 650224;
3. 南京农业大学动物医学院, 南京 210095

收稿日期:2023-01-31 出版日期:2024-01-23 发布日期:2024-01-24
通讯作者: 李华春,主要从事牛羊虫媒病毒研究,E-mail:Li_huachun@hotmail.com;肖雷,主要从事牛羊虫媒病毒研究,E-mail:XL914204@126.com
作者简介:杨恒(1978-),男,四川西昌人,研究员,博士,主要从事牛羊虫媒病毒研究,E-mail:yangheng2008.cool@163.com;李占鸿(1989-),男,大理人,助理研究员,硕士,主要从事牛羊虫媒病毒研究,E-mail:dy081lzh@163.com,Tel:0871-65897407;杨恒和李占鸿为同等贡献作者
基金资助:
昆明学院引进人才科研项目（YJL2210）；国家公益性行业（农业）科研专项（201303035）

Development and Application of Serotyping Real-time Quantitative RT-PCR Methods for Palyam Virus

YANG Heng^1,2, LI Zhanhong², SONG Zi'ang³, GAO Lin², LI Zhuoran², LIAO Defang², XIAO Lei^2*, LI Huachun^2*

1. College of Agriculture and Life Sciences, Kunming University, Kunming 650214, China;
2. Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases Key Laboratory, Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224, China;
3. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Received:2023-01-31 Online:2024-01-23 Published:2024-01-24

摘要/Abstract

摘要： 本研究拟建立帕利亚姆病毒（Palyam virus， PALV）血清型特异性实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列，设计扩增引物和TaqMan探针，建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法，对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估；以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性；利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示，建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性，可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^-1。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致；对PALV不同感染阶段哨兵动物血液（90份）中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致；建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性，可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定，具有良好的应用价值。

关键词: 帕利亚姆病毒, 血清型鉴定, 实时荧光定量RT-PCR, 检测方法

Abstract: The aim of present study was to develop serotyping real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) methods for serotype identification of Palyam virus (PALV) from clinical samples or insect vector. According to segment 2 (Seg-2) sequences of Chinese epidemic PALV strains, PALV serotype-specific qRT-PCR methods were established and their specificity, sensitivity and repeatability were evaluated. The reliability of the established qRT-PCR methods was assessed by 28 Chinese PALV strains and 90 PALV-positive blood samples, then the established methods were applied to identify the serotypes of PALV from the collected Culicoides samples. The established PALV serotyping qRT-PCR methods showed highly specificity and sensitivity, with the minimum copy number of detectable viral nucleic acid ranging from 22 to 28 copies·μL^-1. The qRT-PCR identification results of 28 PALV strains are consistent with the results of virus sequencing. Furthermore, serotype qRT-PCR identification results of 90 PALV-positive blood samples from infected sentinel animals were consistent with serotyping results of the isolated PALVs. The established method can accurately identify the serotype of PALV collected from Culicoides samples. With features of strong specificity, high sensitivity and positive repeatability, the PALV serotype-specific qRT-PCR methods established in this study could be used for rapid and accurate diagnosis of the serotypes of PALV in vectors and animals.

Key words: Palyam virus, serotype identification, real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, detection method

中图分类号:

S852.65

杨恒, 李占鸿, 宋子昂, 高林, 李卓然, 廖德芳, 肖雷, 李华春. 帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(1): 395-400.

YANG Heng, LI Zhanhong, SONG Zi'ang, GAO Lin, LI Zhuoran, LIAO Defang, XIAO Lei, LI Huachun. Development and Application of Serotyping Real-time Quantitative RT-PCR Methods for Palyam Virus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2024, 55(1): 395-400.

参考文献 10

[1]	EBERSOHN K, COETZEE P, SNYMAN L P, et al.Phylogenetic characterization of the palyam serogroup orbiviruses[J].Viruses, 2019, 11(5):446.
[2]	YAMAKAWA M, OHASHI S, KANNO T, et al.Genetic diversity of RNA segments 5, 7 and 9 of the Palyam serogroup orbiviruses from Japan, Australia and Zimbabwe[J].Virus Res, 2000, 68(2):145-153.
[3]	YAMAGUCHI R, TANIMOTO N, TATEYAMA S, et al.Immunohistochemical study of age-dependent brain lesions in mice infected intracerebrally with Kasba (Chuzan) virus[J].J Comp Pathol, 2001, 124(1):36-45.
[4]	MIURA Y, GOTO Y, KUBO M, et al.Isolation of Chuzan virus, a new member of the Palyam subgroup of the genus orbivirus, from cattle and culicoides oxystoma in Japan[J].Am J Vet Res, 1988, 49(12):2022-2025.
[5]	张义爽, 王芳, 武瑞, 等.我国中山病的血清流行病学调查[J].中国预防兽医学报, 2017, 39(1):1-4.ZHANG Y S, WANG F, WU R, et al.The serological epidemiological investigation of Chuzan disease by micro-neutralization test in China[J].Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2017, 39(1):1-4.(in Chinese)
[6]	WANG M, WANG Y, BALOCH A R, et al.Chuzan virus in yaks, Qinghai-Tibetan plateau, China[J].Emerg Infect Dis, 2018, 24(12):2371-2373.
[7]	杨振兴, 朱沛, 李占鸿, 等.我国牛羊中山病血清学调查[J].畜牧兽医学报, 2019, 50(8):1715-1722.YANG Z X, ZHU P, LI Z H, et al.Serological investigation of Chuzan disease of cattle, goat and sheep in China[J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2019, 50(8):1715-1722.(in Chinese)
[8]	YANG H, XIAO L, MENG J X, et al.Complete genome sequence of a Chuzan virus strain isolated for the first time in mainland China[J].Arch Virol, 2016, 161(4):1073-1077.
[9]	杨恒, 肖雷, 李占鸿, 等.2012-2016年中国南方地区帕利亚姆血清群病毒的分离与序列特征分析[J].畜牧兽医学报, 2018, 49(4):761-770.YANG H, XIAO L, LI Z H, et al.Sequence analysis of palyam serogroup virus isolated in south China from 2012 to 2016[J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2018, 49(4):761-770.(in Chinese)
[10]	李占鸿, 李卓然, 宋子昂, 等.帕利亚姆血清群病毒qRT-PCR检测方法的建立与应用[J].病毒学报, 2020, 36(1):100-108.LI Z H, LI Z R, SONG Z A, et al.Establishment of a qRT-PCR for the Palyam serogroup virus[J].Chinese Journal of Virology, 2020, 36(1):100-108.(in Chinese)

[1]	李昭燕, 高江, 郭时惠, 赵茹茜, 马文强. 猫过敏原检测方法与控制措施的研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(6): 2272-2279.
[2]	王华健, 张宁, 杨威, 赵志强, 李茜, 陆安, 田勇, 何欣, 赵兴华, 李杰峰. 3种食源性致病菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(4): 1201-1209.
[3]	刘梦瑶, 王展慧, 吴浩, 谷月, 吴文学. 牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和牛轮状病毒四重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2021, 52(7): 1942-1952.
[4]	麻园, 石正旺, 罗俊聪, 杨波, 王丽娟, 万颖, 宋锐, 曹丽艳, 周改静, 田宏, 郑海学, 陈轶霞. 猪瘟病毒化学发光抗体检测方法的建立与应用[J]. 畜牧兽医学报, 2021, 52(6): 1744-1752.
[5]	梅力, 王英超, 程汝佳, 于国际, 范学政, 高晓龙, 高敏, 秦玉明, 李筱英, 李巧玲, 朱良全, 冯小宇. 1种布鲁氏菌微滴式数字PCR检测方法的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2021, 52(6): 1753-1759.
[6]	任梦雅, 冯潇慧, 解竞静, 文晓宾, 孟庆石, 刘丽莉. 食糜样本中11种生物胺同步检测方法的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(6): 1320-1331.
[7]	王素春, 仲焕香, 姜楠, 姜利建, 潘子豪, 孙福亮, 刘华雷, 黄保续, 王楷宬. H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(6): 1429-1437.
[8]	李慧平, 汤承, 岳华. 实时荧光定量RT-PCR检测牛库布病毒[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(4): 888-893.
[9]	梅力, 王英超, 吴迪, 李月, 宋彦军, 韦海涛, 王林, 高晓龙, 冯小宇. 1种检测新城疫病毒的微滴式数字PCR方法[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(12): 3187-3192.
[10]	王素华, 帅江冰, 李舟, 袁淑辉, 吴绍强, 吕继洲, 赵治国. 炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测技术的建立和应用[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1658-1665.
[11]	郭紫晶, 何琪富, 汤承, 张斌, 岳华. 检测纽布病毒的Real-time RT-PCR方法的建立与应用[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(4): 893-900.
[12]	卢曾奎, 张利平, 李青, 刘恩民, 杜立新, 储明星, 魏彩虹. mRNA中N⁶-甲基腺苷修饰及其在动物中的研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(1): 1-13.
[13]	张跃博, 颜华, 王立刚, 赵福平, 侯欣华, 刘欣, 高红梅, 张龙超, 王立贤. 哺乳动物RNA编辑及其检测方法[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(11): 2299-2309.
[14]	陈亚娜, 王静, 訾占超, 亢文华, 汪葆玥, 倪建强, 原霖. 伪狂犬病病毒微滴数字PCR定量检测方法的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(9): 1705-1710.
[15]	黄鑫，梁剑平，高旭东，郝宝成. 苦马豆素的来源、药理作用及检测方法研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(6): 1075-1085.

帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

Development and Application of Serotyping Real-time Quantitative RT-PCR Methods for Palyam Virus

RichHTML

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献 10

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价