靶向猪ATGL 基因的miRNA预测及鉴定

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.002

摘要/Abstract

摘要：

本试验旨在初步筛选出调控猪脂肪甘油三酯脂肪酶基因（ATGL）的miRNA。利用生物信息学分析预测10条靶向ATGL基因的猪miRNAs，然后通过装载含猪ATGL基因3′UTR序列来构建pMIR-Luc报告基因载体，以及通过装载含反向miRNA种子区对应的3′UTR序列来构建3个突变载体作为阴性对照，以pRL-TK载体作为内参，与候选miRNA模拟物共转染HEK 293T细胞，最终利用双荧光素酶报告基因法来检测荧光素酶活性。试验成功构建了含猪ATGL基因3′UTR序列的重组载体pMIR-ATGL-3′UTR，双荧光素酶报告基因试验显示ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下调293T细胞中pMIR-ATGL-3′UTR的荧光素酶活性，而点突变试验证实了ssc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p能通过与猪ATGL基因3′UTR上预测的种子区结合下调荧光素酶活性。结果表明，sc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p通过靶向结合3′UTR对猪ATGL基因有下调作用。

Abstract:

To preliminary screen out ssc-miRNAs targeting porcine adipose triglyceride lipase gene (ATGL)，10 ssc-miRNAs targeting ATGL were predicted by bioinformatics analysis．3′UTR of porcine ATGL gene was inserted into the pMIR-Luc target reporter vector and transiently co-transfected with candidate miRNA mimics into HEK 293T cells，using pRL-TK vector as an internal control reporter.Three other reporter vectors containing the mutated ssc-miRNAs targeting sites by reversing the seed region of targeting sites were created as negative controls.The dual luciferase reporter assay system was used to evaluate the activity of luciferase．The results showed that pMIR-ATGL-3′UTR recombinant vector was successfully constructed which contained 3′UTR of porcine ATGL gene.Dual luciferase reporter assay showed that ssc-miR-769-3p，ssc-miR-1343，ssc-miR-7137-3p，ssc-miR-671-5p and ssc-miR-149 could down-regulate the luciferase activity of pMIR-ATGL-3′UTR vector in 293T cell，while mutant assay verified ssc-miR-1343 and ssc-miR-7137-3p could down-regulate the luciferase activity by targeting the predicted seed region of 3′UTR of porcine ATGL gene.These results indicated that ssc-miR-1343 and ssc-miR-7137-3p could down-regulate the expression of porcine ATGL gene by targeting its 3′UTR.

中图分类号:

S828.2

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