凸隆病毒（torovirus）作为套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）家族的重要成员，包括马凸隆病毒（EToV）、牛凸隆病毒（BToV）、猪凸隆病毒（PToV）和人凸隆病毒(HToV), 该病毒感染人和动物，主要引起消化道和呼吸道疾病。自该病毒首次于1982年在美国Lowa州被分离得到，迄今已有30余年的研究历史，随着分子生物学和病毒分离培养技术的不断发展，病毒与其宿主间相互作用的机制也得以不断被认知，此篇综述介绍了有关凸隆病毒的最新研究进展，包括病毒的发现及分类，病毒粒子特征、基因结构及功能，引起细胞凋亡的机制，同时包含了病毒变异、血清流行病学、病理变化、诊断方法和关于研究前景的概括。

为了研究野莱F1代猪肌内苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase，MDH)和脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase，LPL)基因表达与肌内脂肪含量及脂肪酸组成的关系，探讨肌内脂肪的沉积机理。本研究以长白山野猪与莱芜猪的杂交1代猪（简称野莱F₁代猪）和长×大白猪（各40头，公母各半）为研究对象，在20、35、50、70、90 kg 5个体重阶段采取背腰最长肌，利用荧光定量RT-PCR方法研究MDH和LPL基因表达的发育性变化，分析该变化与肌内脂肪含量和脂肪酸组成的关系。结果表明：随着体重的增加，野莱F₁猪和长×大白猪肌内MDH基因表达在20～70 kg阶段呈上升趋势，在70～90 kg阶段呈下降趋势；野莱F1猪和长×大白猪肌内LPL基因表达皆呈持续上升的趋势。相关分析表明：野莱F₁猪MDH和LPL mRNA表达均与肌内脂肪含量呈显著正相关（P<0.05），与多不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸的比值（PUFA/SFA）不相关（P>0.05）；长×大白猪MDH和LPL mRNA表达分别与肌内脂肪含量不相关和显著正相关（P>0.05和P<0.05），分别与PUFA/SFA呈极显著和显著负相关（P<0.01和P<0.05）；2种猪肌内PUFA/SFA与肌内脂肪含量皆呈显著负相关（P＜0.05）。结果提示：猪肌内MDH和LPL基因表达皆具有明显的体重发育特征；可以通过控制猪饲料中PUFA的含量来调节猪肉中PUFA的含量，从而影响MDH和LPL的基因表达，达到调节肌内脂肪含量的目的。

 旨在研究绵羊POU2F3（POU class 2 homeobox 3）基因的组织表达规律，并克隆中国美利奴羊（新疆军垦型）POU2F3基因多种剪接体的全长编码区（Coding sequence，CDS区）。采用半定量RT-PCR方法分析绵羊POU2F3基因的组织表达特性；采用RT-PCR扩增绵羊POU2F3基因的全长CDS区，克隆后进行测序分析。组织表达谱分析表明，POU2F3基因仅在绵羊部分内脏器官和组织中表达，其中在皮肤组织中的表达量较高；POU2F3基因在超细毛品系羊体表不同部位皮肤组织中的表达水平差异不显著（P>0.05），在细毛羊和粗毛羊体侧皮肤中的表达量也不存在显著性差异（P>0.05）；序列分析结果表明，POU2F3基因在绵羊皮肤组织中至少存在4种mRNA剪接形式，相应的开放阅读框（Open reading frame，ORF）长度依次为1 290、1 191、666和666 bp，分别编码429、396、221和221个氨基酸。中国美利奴羊(新疆军垦型)POU2F3基因在皮肤组织中具有较高表达水平；绵羊POU2F3基因在皮肤组织中除了全长的POU2F3蛋白外，至少还有2种不同的蛋白剪接体。本研究为阐明绵羊POU2F3基因的功能以及开展优质细毛羊的培育工作奠定了基础。

本研究旨在克隆绵羊YAP1基因CDS序列，构建并鉴定其真核表达质粒pEGFP-C1-YAP1,及其磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1 S42A。本研究利用RT-PCR技术，从湖羊背最长肌克隆YAP1基因编码区序列，T-A克隆到pMD 19-T载体中，进行测序。利用酶切和T4连接酶连接方法，将YAP1基因编码区克隆到pEGFP-C 1载体中，构建pEGFP-C 1-YAP1真核表达载体，以真核表达载体为模板，构建磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1 S42A，2种载体均进行PCR、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切、BamHⅠ单酶切及测序鉴定。结果克隆出YAP1基因的全长cDNA序列，获得GenBank登录号JQ 714252，其长度为1 712 bp，编码区1 212 bp，编码403个氨基酸。重组质粒pEGFP-C1-YAP1经PCR、酶切、测序鉴定，证实YAP1基因CDS区已正确克隆入pEGFP-C1表达载体；经测序鉴定，YAP1第42位丝氨酸成功突变为丙氨酸。本研究成功克隆绵羊YAP1基因全长cDNA序列，并构建了重组真核表达质粒pEGFP-C1-YAP1及磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1 S42A，为进一步研究YAP1蛋白表达及其生物学活性奠定基础。

为筛选STAT3基因启动子区SNPs及研究其对启动子功能元件和体尺性状的影响。选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池，直接测序筛选SNP位点，PCR-RFLP进行验证和基因分型，并利用114头务川黑牛个体分析SNPs位点与8个体尺性状的相关性。结果表明：STAT3基因5′调控区存在7个新SNPs位点，分别为：G-449A、C-341A、A-322G、C-246A、G-240A、C-225T、A-103T，提交SNP数据库得到登录号。生物信息学软件预测得到STAT3基因核心启动子区和CpG岛，SNP位点导致附近大量转录因子结合位点消失和新位点产生。多态性位点对转录因子结合位点有显著影响，但并不改变CpG岛大小。关联性分析结果表明，A-322G对务川黑牛体重有极显著影响（P<0.01），A等位基因为有利等位基因。与AA或GG纯合基因型相比，AG基因型个体有更出色的体重性状。A-322G可能作为影响肉牛生长性状的重要功能性SNP，STAT3基因可能作为肉牛选种选育的候选基因，研究结果为进一步确定STAT3基因功能奠定试验基础。

牛凝血因子XI基因第9外显子15 bp插入突变是近年在日本和牛中发现的一种遗传缺陷，导致凝血因子活性降低。为了分析该缺陷基因在我国牛群中的携带频率，本研究开发了能灵敏检测该突变的2种新方法，即毛细管电泳法和等位基因特异性扩增法，并检测了我国引进的和牛种公牛、1个含和牛血液的杂交育种群和商品群、4个国内地方品种（鲁西牛、延边牛、蒙古牛、复州牛）、2个培育品种（中国荷斯坦牛、新疆褐牛）和6个国外品种（西门塔尔、夏洛来、利木赞、安格斯、蒙贝利亚、挪威红牛）样品共452头份。结果显示，在和牛、含和牛血液的杂交育种群及商品群中突变基因频率分别为0.182、0.389和0.242，在延边牛中发现1头携带者，而在其余群体中均未检出，推测该突变可能只存在于东北亚和我国东北地区牛群中。今后我国在引进和牛用于杂交改良以及本地牛选育中需要对该突变进行分子检测和逐步淘汰，从而降低不利等位基因的频率。

 旨在克隆牦牛可卡因-苯丙胺调节转录肽基因（Cocaine- and amphetamine-regulated transcript，CART），获得基因全长序列并分析基因结构和相关遗传变异，检测单核苷酸多态性（SNP）位点在不同品种牦牛群体中的分布，通过生物信息学相关方法分析预测SNP位点对CART基因表达的影响，为牦牛CART基因功能研究奠定基础。以243头大通牦牛、208头天祝牦牛、208头甘南牦牛和53头帕里牦牛血样为材料，提取基因组DNA，克隆出牦牛CART基因全长序列；运用高分辨率熔解曲线分析技术（High-resolution melting, HRM）检测CART基因4个SNPs在4个牦牛品种中的分布，进行遗传统计分析，并应用生物信息学分析SNPs可能对基因功能产生的影响。本研究发现，牦牛CART基因4个SNPs，1个位于基因上游序列、1个位于内含子、2个位于3′-UTR。Χ²检验表明，除大通牦牛V-221位点和甘南牦牛V1816位点外，其他所有群体各个位点都处于哈代-温伯格平衡（P>0.05）。群体遗传学分析显示，V168和V1816位点属于中度多态，V-221和V1791属于低度多态，单倍型C属于优势单倍型。生物信息分析发现，V1791和V1816位点碱基变化导致RNA二级结构发生变化，可能会对CART基因的表达产生影响。

 为了探究猪精子蛋白32(Sperm protein, sp32)表达及酪氨酸磷酸化调控猪精子顶体蛋白活化的关系，本研究对不同处理（鲜精、冷冻-解冻、获能、顶体反应）的猪精子顶体膜蛋白进行分离，通过考马斯亮蓝染色、SDS-PAGE电泳和Western blot检测和分析。结果表明，猪精子经过获能处理、冷冻-解冻处理以及顶体反应处理后，前顶体蛋白（Proacrosin）和顶体蛋白（Acrosin）在转化过程中，sp32表达有所差异，获能和顶体反应处理的sp32的表达量略高于冷冻-解冻处理组，而显著高于鲜精处理组。与其他处理组相比，冷冻-解冻精子处理组sp32酪氨酸磷酸化水平产生显著的差异。但在SDS-PAGE电泳中，猪鲜精处理组在蛋白质分子质量38~170 ku区间的蛋白表达条带较其他对比组明显，这表明猪精子在受精前所必需经历的获能和顶体反应过程中，顶体膜蛋白伴随着大分子的蛋白质修饰和降解。结论：sp32作为一种前顶体蛋白结合蛋白，在前顶体蛋白活化过程中它的表达水平及酪氨酸磷酸化水平上调。

 为了解牛卵丘-卵母细胞复合体（COCs）体外成熟过程中Ghrelin对卵丘细胞增殖的可能调节及其与促卵泡素（Follicle-stimulating hormone，FSH）在卵丘细胞增殖过程中可能的调控关系，本研究运用实时定量RT-PCR技术首先检测了体外不同成熟时间（0 、8 、16和24 h）牛卵丘细胞中Ghrelin mRNA的相对表达差异，然后在体外成熟8 h，探讨了FSH与FSH受体结合抑制剂（FSH binding inhibitor,FSHBI）对Ghrelin mRNA表达的影响，以及FSH与Ghrelin受体抑制剂（［D-Lys³］-GHRP-6）对增殖相关基因PCNA，BCL-2和BAX mRNA表达可能的调节作用；最后利用细胞增殖活性测定技术检测了FSH与［D-Lys³］-GHRP-6对卵丘细胞增殖活性的影响。结果显示:（1）Ghrelin mRNA相对水平在体外成熟8 h卵丘细胞中最高,显著高于0和24 h组（P<0.05）；（2）0.01 IU·mL^-1 FSH添加组与对照组相比，Ghrelin mRNA表达显著升高（P<0.05）；在添加400 ng·mL^-1 FSHBI后，Ghrelin mRNA表达下降且差异显著（P<0.05）；（3）添加FSH后，PCNA和BCL-2 mRNA表达以及卵丘细胞增殖活性显著升高（P<0.05）；添加［D-Lys³］-GHRP-6后，上述基因表达水平与增殖活性显著降低（P<0.05）。上述结果表明，Ghrelin参与FSH对体外成熟过程卵丘细胞增殖的调节，本研究结果有助于进一步了解FSH调控卵泡发育的机制。

旨在研究沼泽型水牛成熟前后卵泡内差异表达蛋白质的变化规律。采用双向凝胶电泳技术分离成熟卵泡液和未成熟卵泡液总蛋白质，建立和优化了卵泡液的双向电泳体系，并使用质谱鉴定差异表达蛋白点。结果显示，丙酮沉淀法处理得到的总蛋白质样品后，在24 cm（pH 4~7）胶条且上样量350 μg时得到分辨率较好的双向电泳图谱。软件分析得到11个差异蛋白点，以成熟卵泡液作为对照，5个蛋白点表达上调，3个蛋白点表达下调，1个蛋白点缺失，2个蛋白点在未成熟卵泡液中特异性表达。质谱成功鉴定出4个蛋白质：过氧化物酶-2、醛糖还原酶、牛纤维蛋白原的晶体结构、转甲状腺素蛋白。该研究建立了良好的卵泡液双向电泳体系，分析并鉴定一批水牛卵泡液差异蛋白质，对于研究水牛卵母细胞的发育微环境和成熟机制提供了新的研究线索。

旨在研究雄激素受体（Androgen receptors，ARs）基因在绵羊公羔不同组织中的表达特性及在性腺中的定位。本研究以QRT-PCR法检测各组织AR mRNA表达规律，免疫组化技术对睾丸和附睾中AR进行定位分析，蛋白质印迹技术对AR蛋白表达量进行定性研究。结果显示：（1）AR 在不同组织中均有不同程度的表达，其中在睾丸和心脏中大量表达；（2）在附睾头、体、尾部单层柱状上皮细胞和间质细胞中检测到较弱的阳性信号；睾丸组织间质细胞、精原细胞、管周肌样细胞检测到强阳性信号。综上表明：AR在绵羊不同组织中广泛表达，AR在性腺的发育和精子的成熟过程以及对心脏的保护方面发挥重要作用，其作用机制需进一步研究。

旨在研究纯化的大豆球蛋白对离体培养的仔猪空肠上皮细胞（IPEC细胞）通透性以及对细胞间紧密连接蛋白Occludin mRNA表达的影响。将不同浓度的大豆球蛋白(0~5.0 mg·mL^-1)与肠上皮细胞共同培养24 h后，检测跨上皮细胞电阻值并用实时荧光定量PCR方法研究Occludin mRNA表达的变化规律。结果表明，与对照组相比，除大豆球蛋白浓度为0.5 mg·mL^-1时无明显变化，其他各浓度跨上皮细胞电阻值和Occludin mRNA相对表达量均呈显著下降趋势（P<0.001）。由此可知，大豆球蛋白使仔猪小肠上皮细胞通透性增加并使Occludin mRNA表达量下降，进一步明确了大豆球蛋白影响细胞增殖且对肠上皮细胞造成直接损伤，并破坏了肠上皮细胞完整性。

本试验旨在研究妊娠后期营养限饲对蒙古绵羊胎儿肝脏生长发育及抗氧化能力的影响。选择健康的蒙古绵羊42只(经同期发情受孕)，在妊娠90 d时选择6只母羊进行屠宰，其余按体重随机分配到3个组：限制组1 (0.175 MJ ME·kgw^-0.75·d^-1，n=14，RG1)、限制组2(0.33 MJ ME·kgw^-0.75·d^-1，n=12，RG2)和自由采食组(0.67 MJ ME·kgw^-0.75·d^-1，n=10，CG)，进行不同能量水平饲养。饲喂至妊娠140 d，各组再选择6只母羊进行屠宰。结果表明，RG1组胎儿重(P<0.01)、胎儿肝脏重(P<0.01)、肝脏中DNA浓度(P<0.01)、蛋白浓度(P<0.01)、总DNA含量(P<0.01)、蛋白质/DNA(P<0.01)、总抗氧化能力(P<0.01)、超氧化物歧化酶活性(P<0.05)显著低于CG组，而谷胱甘肽过氧化物酶活性(P<0.05)和丙二醛浓度(P<0.01)显著高于CG组；RG2组胎儿重(P<0.01)、肝脏重(P<0.05)、肝脏中DNA浓度(P<0.01)、蛋白浓度(P<0.01)、总DNA含量(P<0.01)、蛋白质/DNA(P<0.01)、总抗氧化能力(P<0.01)显著低于CG组，而丙二醛浓度(P<0.01)显著高于CG组。结果显示，妊娠后期营养限饲蒙古绵羊严重影响了其胎儿肝脏的生长发育和抗氧化能力，而且随着营养水平的降低，发育受阻程度加深，抗氧化防御敏感性增强。

 旨在探讨改善西藏地区青稞秸秆和多年生黑麦草混合青贮发酵品质和营养价值的措施，以进一步提高西藏地区秸秆资源的利用效率。将青稞(Hordeum vulgare )秸秆与多年生黑麦草(Lolium perenne)以6︰4混合，分别添加0、1.5、2.0和2.5 mL·kg^-1的酶制剂，青贮后第7、14、30和60天取样分析，评定青贮饲料发酵品质及营养价值。添加酶制剂改善了混合青贮发酵品质，显著提高了乳酸含量和乳酸/乙酸值（P<0.05），显著降低了pH和氨态氮/总氮（P<0.05），抑制了乙酸、丙酸和丁酸的产生。青贮60 d后酶添加组氨态氮/总氮为对照组的1/2，而水溶性碳水化合物(WSC)含量为对照组的2倍，且酶添加组有较高的粗蛋白含量和较低的中性洗涤纤维含量。从长期保存和营养价值考虑，将青稞秸秆与黑麦草混合（6∶4）并添加酶制剂青贮利于长期保存。

 利用扩增禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列（LTR）的特异性引物作为检测引物，对采集于吉林省某地健康野鸭的脏器样品进行PCR检测。阳性样品经DF1培养增殖，进行病毒的分离，经PCR和间接免疫荧光（IFA）方法鉴定，确定分离到2株REV，分别来自于针尾鸭和绿头鸭，将分离病毒分别命名为DBYR1101和DBYR1102。克隆2个病毒株的主要保护性抗原基因gp90，并进行序列分析。结果显示，2个分离株gp90基因氨基酸相似性为99.5%；DBYR1101 gp90基因与REV 3个型的代表株170A、SNV和CSV的氨基酸相似性分别为95.7%、94.2%和98.2%；DBYR1102 gp90基因与REV 3个型的代表株170A、SNV和CSV的氨基酸相似性分别为95.2%、93.7%和97.7%；与中国早期南方分离株HA9901的氨基酸序列相似性分别为94.7％和94.2％；与中国北方分离株氨基酸序列相似性为99.2％~100%。核苷酸遗传进化分析表明，2个野鸟源REV分离株与现有的东北分离株亲缘关系较近，趋于形成1个北方分离群；与SNV株亲缘关系最远；与170A株亲缘关系较远；与美国和中国台湾地区的某些分离株相似性较高。该研究首次自野鸭体内分离到REV，丰富了REV流行病学资料，同时提醒我们重视野生鸟类迁徙在疾病传播中所扮演的角色，为深入研究REV致病机制、免疫抑制机制等奠定基础。

比较不同毒力猪肺炎支原体的脂膜蛋白（LAMPs）对猪肺泡上皮细胞生长抑制作用的差异。使用Trion-X114从猪肺炎支原体培养物中提取LAMPs，采用MTT法检测LAMPs对细胞生长的抑制率，观察其对细胞生长状况的影响，并使用Griess试剂对细胞培养物中NO的浓度变化进行测定。结果表明，4株猪肺炎支原体的LAMPs均对猪肺泡上皮细胞SJPL有抑制作用，其抑制作用的强度与猪肺炎支原体的毒力强弱基本相符，即NJ株与168株的抑制作用较强，而168致弱株及J株对SJPL细胞的抑制作用较弱。其中，NJ株的IC₅₀最低，为0.13 mg·mL^－1；而J株的IC₅₀最高，为0.56 mg·mL^－1，并且LAMPs可以诱导细胞产生NO。猪肺炎支原体LAMPs对猪肺泡上皮细胞的抑制作用与支原体的毒力相关，强毒株LAMPs的抑制作用较大，而弱毒株的抑制作用较小。

NF-κB信号通路在病毒感染、免疫损伤性疾病、肿瘤疾病中发挥重要作用，其活化水平常作为机体免疫应答水平、疾病发展进程的检测指标。为获得猪NF-κB p65/p50基因序列特征并建立体外定量检测其表达水平的实时荧光定量PCR方法，作者对猪NF-κB p65 ORF和成熟p50编码区进行RT-PCR扩增、克隆、测序及生物信息学分析；设计特异性荧光定量引物，建立检测p65、p50实时荧光定量PCR方法。结果显示：所扩增的猪NF-κB p65 ORF长1 662 bp，编码553 aa，成熟p50编码区长1 653 bp，编码551 aa；与不同动物的p65、p50序列相似性均较高；56.5% p65位于细胞核内，78.3% p50存在于细胞质中，p65、p50均无信号肽及跨膜区。荧光定量结果表明：起始模板与Ct值之间线性关系好，相关系数达到0.999，扩增效率均在95%左右；敏感性高，初始模板的检出下限达到10¹ copies·μL^－1；特异性强，扩增产物形成单一的特异性熔解峰；重复性好，组内变异系数均小于5‰。本试验为进一步研究猪NF-κB p65/p50生物学功能及其在猪相关疾病发生发展中表达量变化奠定了基础。

 本研究旨在研制快速检测饲料中喹乙醇的ELISA试剂盒（OLA-Kit）。作者用喹乙醇单克隆抗体（OLA mAb）建立间接竞争ELISA方法，组装OLA-Kit，并对试剂盒的性能进行评估。结果表明：OLA-Kit的标准曲线呈典型的反S型，相关系数R² =0.976 7，线性范围为1～243 μg· L^－1，半数抑制浓度（IC₅₀）为（14.29±3.75） μg· L^－1，检测限为0.79 μg· L^－1，定量限为4.0 μg· L^-1，临界值（猪饲料）为83.37 μg· g^－1，基质对该试剂盒的检测结果影响不大；猪、鸡、鱼饲料的不同浓度添加回收率均大于74.40%，平均批内和批间变异系数均小于15%；试剂盒与喹胺醇的交叉反应率（CR%）为17.93%，与MQCA、QCA及其他喹喔啉类药物几乎无反应性，可在2～8 ℃保存6个月以上；OLA-Kit与HPLC法测定猪饲料中喹乙醇添加回收率没有显著差异（P≥0.05）。本研究成功研制出敏感、特异、准确的喹乙醇ELISA检测试剂盒，可用于饲料中该药物的快速检测和批量筛查。

本研究旨在为进一步探讨胸腺生理或免疫功能提供形态学资料。选取3个年龄段（1日龄、5月龄及成年）健康牦牛的胸腺样本，通过组织学、免疫组织化学和统计学的方法对牦牛胸腺组织结构增龄性变化进行研究。结果显示，随着增龄，牦牛胸腺皮、髓质分界不清，细胞排列稀疏，小叶间结缔组织和脂肪组织增多占据了胸腺原有的功能区，被膜增厚；各年龄段S100阳性胸腺树突状细胞(TDCs)位于皮髓交界、髓质区域，单位面积内此种细胞的数量随增龄下降，各年龄段组间差异极显著（P<0.01）；单位面积内 Caspase-3阳性胸腺凋亡细胞平均数目随增龄上升，各年龄段牦牛胸腺皮质单位面积内此种细胞数目组间差异极显著（P<0.01），而5月龄与成年牦牛髓质单位面积内此种细胞数目差异不显著（P>0.05），但二者均与1日龄时差异极显著（P<0.01）。结果提示，随着增龄，牦牛胸腺结构呈退化趋势；胸腺功能减退，这可能与抗原递呈细胞(TDCs)的数量下降和皮质胸腺细胞凋亡现象显著相关，其机制有待于进一步研究。

本研究旨在分析头孢噻呋在猪体内的残留消除规律，并为制定休药期提供依据。改进了猪可食性组织中头孢噻呋残留检测的高效液相色谱法（HPLC），试验猪按体重以5 mg·kg^－1肌注给药，连续给药3 d，分别在最后一次给药后第12 小时及第3、5、7、9 天随机宰杀5头猪取样。样品先用二硫赤藓糖醇提取，再用碘乙酰胺衍生化后经MCX固相萃取小柱净化，经高效液相色谱C₁₈柱分离后用紫外检测器检测。结果显示：给药后第12小时肾脏组织中的药物浓度最高，为2.589 μg·g^－1，第3天所有组织的药物浓度均低于最高残留限量（MRL）。采用Winnonlin软件计算各组织的消除动力学参数，消除快慢依次为皮脂、肌肉、肝、肾和注射位点，其消除半衰期（t_1/2β）分别为28.99、35.80、36.76、55.72和160.8 h。肾的药时曲线下面积（AUC）最高，为123.4 h·μg·g^－1，说明肾脏是头孢噻呋作用的靶器官。参照EMEA对头孢噻呋制定的MRL，计算得注射位点的休药期最长，为98.64 h。结果提示水性头孢噻呋注射液吸收迅速，体内分布广，消除较快，建议休药期为5 d。

为研究11月份间情期水貂卵母细胞的发育规律，探索其体外培养成熟的可能性,本研究利用透射电镜对间情期美国短毛黑水貂卵巢的腔前卵泡卵母细胞的超微结构进行观察。结果发现：在原始卵泡阶段，卵母细胞线粒体的嵴较少，高尔基体可见，脂滴大小不一，皮质颗粒分散在细胞核周围；初级卵泡阶段，线粒体数量增加，高尔基体趋于典型，脂滴分布均匀，皮质颗粒在质膜附近呈单层分布；次级卵泡阶段，线粒体嵴的数量增加，高尔基体在质膜下成群分布，脂滴增大、颜色变浅。11月份间情期水貂卵母细胞皮质颗粒和高尔基体的发育与发情期相比在分布位置上有所不同，而线粒体、内质网、脂滴等细胞器的发育与发情期的变化趋势基本一致，说明该时期水貂卵巢卵母细胞有体外培养成熟的可能。

克隆秦川牛的SREBP1基因并构建重组腺病毒表达载体，包装扩繁获得高滴度病毒，拟为在细胞水平上开展基因功能的研究奠定基础。本试验以秦川牛脂肪组织为试验材料，提取总RNA并反转得到cDNA，以GenBank收录的牛的SREBP1基因mRNA序列设计引物，PCR扩增SREBP1基因与克隆载体pMD19-T Simple连接并测序鉴定。挑选测序正确的SREBP1基因酶切后连接到腺病毒穿梭载体上构建pAdTrack-CMV-SREBP1表达载体，用PmeⅠ限制酶酶切线性化，然后转染到含有骨架载体pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受态进行同源重组，得到腺病毒重组载体pAd-SREBP1。用PacⅠ限制酶酶切线性化pAd-SREBP1载体并回收质粒大片段，转染293A细胞包装病毒并扩繁提高病毒滴度，绿色荧光蛋白(GFP)标记法测定腺病毒的滴度。本试验成功克隆了秦川牛的SREBP1基因，测序结果与GenBank收录的牛的基因序列比较有2处位点突变，均已排除扩增酶的保真性不高等外界因素造成的。将SREBP1基因与穿梭载体连接构建了pAdTrack-CMV-SREBP1表达载体，并与骨架载体重组得到重组腺病毒载体pAd-SREBP1，用PacⅠ酶切线性化包装病毒，扩繁得到病毒滴度为1.5×10⁹ GFU·mL^－1高滴度病毒。本研究成功克隆秦川牛SREBP1基因并重组成病毒重组子，包装扩繁得到高滴度腺病毒。

本试验旨在构建4条鸡斑联蛋白（zyxin）基因的RNAi慢病毒载体，对其进行滴度测定，并进行有效干扰靶点的筛选，为以后开展鸡zyxin基因抗球虫机理的研究奠定基础。提取鸡胸腺组织的RNA，反转录，扩增zyxin基因的编码区，并将其克隆到真核表达载体Pex-6上。设计针对zyxin的shRNA序列，应用基因重组技术插入到Lv3慢病毒表达载体中，将lv3-shRNA载体与包装质粒pGag/Pol、pRev、Pvsv-G共转染293T细胞，进行病毒包装。将得到的病毒原液10倍稀释6个梯度，分别转染293T细胞，进行滴度的测定。将构建好的4条慢病毒载体与Pex-6-zyxin真核表达载体共转染293T细胞，运用RT-PCR和Western-blot方法进行有效干扰靶点的筛选。构建4条针对目的基因zyxin的RNAi慢病毒穿梭质粒表达载体CO1、CO2、CO3、CO4和1个阴性对照质粒，经测序鉴定正确；共转染293T细胞包装病毒并浓缩后滴度达1×10⁸ TU·mL^－1，适合感染目的细胞，经过筛选，CO3对zyxin在293T细胞中的表达干扰效果最佳。成功构建了zyxin基因RNA干扰慢病毒表达载体，并进行了有效干扰靶点的筛选，为进一步研究zyxin基因的功能奠定了基础。