牛结节性皮肤病病毒ORF002蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2025.11.038

畜牧兽医学报 ›› 2025, Vol. 56 ›› Issue (11): 5817-5825.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2025.11.038

牛结节性皮肤病病毒ORF002蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

张亚岭(), 景伟(), 赵妍, 何小兵, 房永祥, 苏洋, 李小明, 张慧, 景志忠*(), 陈国华*()

中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室, 兰州 730046

收稿日期:2024-12-04 出版日期:2025-11-23 发布日期:2025-11-27
通讯作者: 景志忠,陈国华 E-mail:3200732270@qq.com;2635378262@qq.com;zhizhongj@163.com;chenguohua02@caas.cn
作者简介:张亚岭(1998-)，女，甘肃玉门人，硕士生，主要从事人畜共患病及兽医公共卫生学研究，E-mail：3200732270@qq.com
景伟(1996-)，男，甘肃静宁人，博士生，主要从事兽医公共卫生学研究，E-mail；2635378262@qq.com
第一联系人：
张亚岭和景伟是同等贡献作者
基金资助:
“十四五”国家重点研发计划(2023YFD1802501)；兰州市科技计划项目(2023-1-38)；国家自然科学基金面上项目(32473069)；甘肃省科技重大专项(23ZDNA007)；国家动物疫情监测与防治专项(125161031)

Establishment of Prokaryotic Expression of the ORF002 Protein of Lumpy Skin Disease Virus and an Indirect ELISA Antibody Detection Method

ZHANG Yaling(), JING Wei(), ZHAO Yan, HE Xiaobing, FANG Yongxiang, SU Yang, LI Xiaoming, ZHANG Hui, JING Zhizhong*(), CHEN Guohua*()

State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China

Received:2024-12-04 Online:2025-11-23 Published:2025-11-27
Contact: JING Zhizhong, CHEN Guohua E-mail:3200732270@qq.com;2635378262@qq.com;zhizhongj@163.com;chenguohua02@caas.cn

摘要/Abstract

摘要：

本研究旨在建立一种基于牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ORF002蛋白的间接ELISA抗体检测方法。通过构建重组质粒pET-30a(+)-ORF002并诱导表达，获得相对分子质量约为13 ku的蛋白，以SDS-PAGE和Western blot验证后的ORF002蛋白为包被抗原，建立LSDV间接ELISA抗体检测方法并进行条件优化。优化后的间接ELISA条件为：抗原包被浓度2.5 μg·mL^-1，血清稀释度1∶100，二抗稀释度1∶120 000。结果判定标准为待检样品OD_{450 nm}值≥标准阳性值×20.34%为阳性，反之为阴性。重复性试验变异系数 < 10%，与多种病毒阳性血清无交叉反应。该方法具有良好的敏感性、特异性及重复性，适用于LSD感染临床血清样品检测和疫苗免疫效果评价。

关键词: 牛结节性皮肤病, ORF002, 原核表达, 间接ELISA

Abstract:

The aim of this study was to establish an indirect ELISA antibody detection method based on the ORF002 protein of the Lumpy Skin Disease Virus (LSDV). By constructing the recombinant plasmid pET-30a(+) -ORF002 and inducing its expression, a protein with a molecular mass of approximately 13 ku was obtained. The ORF002 protein, verified by SDS-PAGE and Western blot, was used as the encapsulation antigen to establish an indirect ELISA antibody detection method for LSDV and to optimize the conditions. The optimized conditions for the indirect ELISA were as follows: antigen encapsulation concentration of 2.5 μg·mL^-1, serum dilution of 1∶100, secondary antibody dilution of 1∶120 000, and the OD_{450 nm} value of the sample≥standard positive value×20.34% was determined as positive, conversely, OD_{450 nm} value below this threshold were considered negative. The coefficient of variation from the repeatability test was < 10%, and there was no cross-reactivity observed with positive sera from various viruses. This method demonstrates good sensitivity, specificity, and reproducibility, making it suitable for the detection of LSDV in clinical serum samples and for evaluating the effectiveness of vaccine immunization.

Key words: lumpy skin disease, ORF002, prokaryotic expression, indirect ELISA

中图分类号:

S852.659.1

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ZHANG Yaling, JING Wei, ZHAO Yan, HE Xiaobing, FANG Yongxiang, SU Yang, LI Xiaoming, ZHANG Hui, JING Zhizhong, CHEN Guohua. Establishment of Prokaryotic Expression of the ORF002 Protein of Lumpy Skin Disease Virus and an Indirect ELISA Antibody Detection Method[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2025, 56(11): 5817-5825.

图/表 7

表 1

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图 2

图 3

表 2

图 4

表 3

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引物名称 Primers’ name	序列(5′→3′) Sequence
ORF002-Nde Ⅰ-F	$\underline{{\rm{GGAATTC}}}$CATATGAAGCTGATTAGCTTTATGTTCGG
ORF002-Xho Ⅰ-R	CTACTCGAGTTATTCCACCATATTCATCATACGTTC

血清稀释度 Serum dilution	样品 Sample	抗原包被浓度 Antigen concentration
血清稀释度 Serum dilution	样品 Sample	20.0	10.0	5.0	2.5	1.25	0.625
1∶100	P	1.361	1.308	1.258	1.290	1.263	1.266
	N	0.293	0.290	0.271	0.278	0.270	0.264
	P/N	4.578	4.641	4.736	5.088	4.663	3.981
1∶200	P	1.000	0.949	0.926	0.937	0.94	0.925
	N	0.231	0.219	0.203	0.195	0.202	0.193
	P/N	4.331	4.681	4.722	5.109	4.470	3.875
1∶400	P	0.628	0.601	0.564	0.564	0.562	0.579
	N	0.181	0.162	0.162	0.149	0.151	0.141
	P/N	3.583	3.627	3.908	3.930	2.694	2.586
1∶800	P	0.396	0.384	0.370	0.365	0.357	0.303
	N	0.145	0.127	0.122	0.114	0.122	0.115
	P/N	2.868	3.114	2.685	2.689	2.452	2.060

方法 Method	血清 Serum	竞争 ELISA Competitive ELISA		合计 Total	符合率/% Concordance level
方法 Method	血清 Serum	阳性血清 Positive serum	阴性血清 Negative serum	合计 Total	符合率/% Concordance level
间接ELISA Indirect ELISA	阳性血清 Positive serum	38	4	42	90.47
	阴性血清 Negative serum	0	12	12	100.00
	合计 Total	38	16	54	92.59

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牛结节性皮肤病病毒ORF002蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

Establishment of Prokaryotic Expression of the ORF002 Protein of Lumpy Skin Disease Virus and an Indirect ELISA Antibody Detection Method

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