靶向猪ATGL 基因的miRNA预测及鉴定

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.002

摘要/Abstract

摘要：

本试验旨在初步筛选出调控猪脂肪甘油三酯脂肪酶基因（ATGL）的miRNA。利用生物信息学分析预测10条靶向ATGL基因的猪miRNAs，然后通过装载含猪ATGL基因3′UTR序列来构建pMIR-Luc报告基因载体，以及通过装载含反向miRNA种子区对应的3′UTR序列来构建3个突变载体作为阴性对照，以pRL-TK载体作为内参，与候选miRNA模拟物共转染HEK 293T细胞，最终利用双荧光素酶报告基因法来检测荧光素酶活性。试验成功构建了含猪ATGL基因3′UTR序列的重组载体pMIR-ATGL-3′UTR，双荧光素酶报告基因试验显示ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下调293T细胞中pMIR-ATGL-3′UTR的荧光素酶活性，而点突变试验证实了ssc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p能通过与猪ATGL基因3′UTR上预测的种子区结合下调荧光素酶活性。结果表明，sc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p通过靶向结合3′UTR对猪ATGL基因有下调作用。

关键词: 猪, ATGL基因, miRNA, 双荧光素酶报告基因系统, 3&prime, UTR

Abstract:

To preliminary screen out ssc-miRNAs targeting porcine adipose triglyceride lipase gene (ATGL)，10 ssc-miRNAs targeting ATGL were predicted by bioinformatics analysis．3′UTR of porcine ATGL gene was inserted into the pMIR-Luc target reporter vector and transiently co-transfected with candidate miRNA mimics into HEK 293T cells，using pRL-TK vector as an internal control reporter.Three other reporter vectors containing the mutated ssc-miRNAs targeting sites by reversing the seed region of targeting sites were created as negative controls.The dual luciferase reporter assay system was used to evaluate the activity of luciferase．The results showed that pMIR-ATGL-3′UTR recombinant vector was successfully constructed which contained 3′UTR of porcine ATGL gene.Dual luciferase reporter assay showed that ssc-miR-769-3p，ssc-miR-1343，ssc-miR-7137-3p，ssc-miR-671-5p and ssc-miR-149 could down-regulate the luciferase activity of pMIR-ATGL-3′UTR vector in 293T cell，while mutant assay verified ssc-miR-1343 and ssc-miR-7137-3p could down-regulate the luciferase activity by targeting the predicted seed region of 3′UTR of porcine ATGL gene.These results indicated that ssc-miR-1343 and ssc-miR-7137-3p could down-regulate the expression of porcine ATGL gene by targeting its 3′UTR.

Key words: pig, ATGL gene, miRNA, dual luciferase reporter system, 3′UTR

中图分类号:

S828.2

戴丽荷，褚晓红，路伏增，黄孙平，徐如海. 靶向猪ATGL 基因的miRNA预测及鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(8): 1281-1289.

DAI Li-he，CHU Xiao-hong，LU Fu-zeng，HUANG Sun-ping，XU Ru-hai. Prediction and Validation of miRNA Targeting Porcine ATGL Gene[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2015, 46(8): 1281-1289.

参考文献

［1］ZIMMERMANN R，STRAUSS J G，HAEMMERLE G，et al.Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase［J］.Science，2004，306：1383-1386.
［2］JENKINS C M，MANCUSO D J，YAN W，et al.Identification，cloning，expression，and purification of three novel human calcium-independent phospholipase A2 family members possessing triacylglycerol lipase and acylglyceroltransacylase activities［J］.J Biol Chem, 2004，279(47)：48968-48975.
［3］VILLENA J A，ROY S，SARKADI-NAGY E，et al.Desnutrin，an adipocyte gene encoding a novel patatin domain-containing protein，is induced by fasting and glucocorticoids：ectopic expression of desnutrin increases triglyceride hydrolysis［J］.J Biol Chem，2004，279(45)：47066-47075.
［4］LANGIN D，DICKER A，TAVERNIER G，et al.Adipocyte lipases and defect of lipolysis in human obesity［J］. Diabetes，2005，54(11)：3190-3197.
［5］LAKE A C，SUN Y，LI J L，et al.Expression，regulation，and triglyceride hydrolase activity of Adiponutrin family members［J］.J Lipid Res，2005，46：2477-2487.
［6］HAEMMERLE G A，LASS R，ZIMMERMANN G，et al.Defective lipolysis and altered energy metabolism in mice lacking adipose triglyceride lipase［J］.Science，2006，312：734-737.
［7］BARTEL D P.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116(2)：281-297.
［8］郑永霞，焦炳华.MiRNA 的生物形成及调控基因表达机制［J］.生命的化学，2010，30(6)：821-826.
ZHENG Y X，JIAO B H.Biogenesis of microRNA and mechanism of the regulation of gene expression［J］.Chemistry of Life，2010，30(6)：821-826.(in Chinese)
［9］XU P，VERNOOY S Y，GUO M，et al.The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism［J］.Curr Biol，2003,13(9):790-795.
［10］WILFRED B R，WANG W X，NELSON P T.Energizing miRNA research：a review of the role of miRNAs in lipid metabolism，with a prediction that miR-103/107 regulates human metabolic pathways［J］.Mol Genet Metab，2007，91(3)：209-217.
［11］ESAU C，DAVIS，MURRAY S F，et al.MiR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting［J］.Cell Metab，2006，3(2)：87-98.
［12］POY M N，ELIASSON L，KRUTZFLDT J，et al.A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion［J］.Nature，2004，432(7014)：226-230.
［13］WANG Q Y，LI C，WANG J H，et al. MiR-1792 cluster accelerates adipocyte differentiation by negatively regulating tumor suppressor Rb2/ p130［J］.Proc Natl Acad Sci U S A, 2008，105(8):2889-2894.
［14］李国喜.猪脂肪组织发育相关miRNA的鉴定及miR-103生物学功能的初步研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2011.
LI G X.Identification of microRNAs related to the swine adipose tissue development and primary research on the biological roles of miR-103［D］.Yangling：Northwest Agriculture and Forestry University，2011.(in Chinese)
［15］ESAU C，KANG X，PERALTA E, et al.MicroRNA-143 regulates adipocyte differentiation［J］. J Biol Chem, 2004，279(50)：52361-52365.
［16］李鹏昊.MiR-27a、miR-143对猪脂肪沉积和miR-1、miR-206对肌肉肥大的调控研究［D］.雅安：四川农业大学，2011.
LI P H.Roles of miR-1、miR-206、miR-27a、miR-143 in the fat deposition and muscular hypertrophy of swine［D］.Yaan：Sichuan Agricultural University，2011.(in Chinese)
［17］LI H，CHEN X，GUAN L，et al.MiRNA-181a regulates adipogenesis by targeting tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the porcine model［J］.PLoS ONE，2013，8(10)：e71568.
［18］DAS S K.Role of lipolysis in cancer associated cachexia and regulation of lipolysis by microRNA 124a［D］.Graz：Medical University of Graz，2011.
［19］ZHAO Y，RANSOM J F，LI A，et al.Dysregulation of cardiogenesis，cardiac conduction，and cell cycle in mice lacking miRNA-1-2［J］.Cell，2007，129(2)：303-317.
［20］BARTEL D P.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］. Cell，2004，116(2)：281-297.
［21］LI G，LI Y，LI X，et al.MicroRNA identity and abundance in developing swine adipose tissue as determined by Solexa sequencing［J］.J Cell Biochem，2011，112(5)：1318-1328.
［22］CHEN C，DENG B，QIAO M，et al.Solexa sequencing identification of conserved and novel microRNAs in backfat of large white and chinese Meishan pigs［J］.PLoS ONE，2012，7(2)：e31426.
［23］CHEN T，XI Q Y，YE R S，et al.Exploration of microRNAs in porcine milk exosomes［J］. BMC Genomics，2014，15:100.
［24］PODOLSKA A，ANTHON C，BAK M，et al.Profiling microRNAs in lung tissue from pigs infected with Actinobacillus pleuropneumoniae［J］. BMC Genomics，2012，13：459.
［25］CHO W C S.OncomiRs：the discovery and progress of microRNAs in cancers［J］.Mol Cancer，2007，6(2)：60-67.
本刊相关报道（以下文章由本刊网站www.xmsyxb.com可以免费下载查阅）：
1.史铭欣，荣恩光，周纬男，等.高、低脂鸡脂肪组织ATGL基因的表达及其激素调控的差异分析［J］.畜牧兽医学报，2013，44(12)：1874-1881.
SHI M X，RONG E G，ZHOU W N，et al.Adipose tissue expression and hormonal regulation of ATGL gene in the fat and lean broiler lines［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2013，44(12)：1874-1881.(in Chinese)
2.崔欢欢，昝林森，王洪宝，等.牛ATGL基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究［J］.畜牧兽医学报，2010，41(2)：141-146.
CUI H H，ZAN L S，WANG H B，et al.cDNA cloning，sequence analysis and tissue expression of bovine ATGL gene［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2010，41(2)：141-146.(in Chinese)

[1]	王璟, 滑留帅, 陈俊峰, 张家庆, 任巧玲, 白红杰, 郭红霞, 徐照学, 邢宝松, 白献晓, 曹海. 去势对淮南公猪背最长肌转录组的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(9): 1746-1758.
[2]	郭晓红, 郭玉龙, 刘亚丹, 刘娟, 史文倩, 董磊, 蔡春波, 曹果清, 李步高, 高鹏飞. 仔猪不同发育阶段结肠微生物菌群特征分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(9): 1759-1774.
[3]	刘国庆, 张丽阳, 马雪莲, 王良治, 刘东元, 邢冠中, 杨柳, 李素芬, 廖秀冬, 吕林, 罗绪刚. 我国畜禽饲料资源中矿物质元素磷含量的调查研究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(9): 1841-1848.
[4]	付绍祖, 李露露, 张敬, 李丹, 郑海学. 猪源DDX56对口蹄疫病毒的复制及其对病毒诱导的RLR通路调节的研究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(9): 1849-1856.
[5]	王昌英, 鹿红宇, 隋敏敏, 王岩超, 刘根, 孙亿, 姜运良. 猪SERPINC1基因对PCV2复制的效应及其转录调控[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1545-1553.
[6]	温东旭, 张雷, 索朗斯珠, 牛家强, 王玉恒, 贡嘎, 旦巴次仁, 席广银, 郭敏, 徐业芬. 牦牛Nramp1基因mRNA组织表达谱及其相关miRNAs初步研究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1576-1586.
[7]	胡永新, 赵永刚, 张永强, 刘拂晓, 樊晓旭, 吴晓东, 王志亮. 表达非洲猪瘟病毒P72蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1635-1641.
[8]	侯林杉, 贾敬亮, 顾文源, 刘宝京, 师乾凯, 袁广富, 陈少杰, 范京惠, 左玉柱. 基于猪丁型冠状病毒重组S1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1642-1648.
[9]	邱静静, 丁轲, 余祖华, 贾艳艳, 张春杰, 汪洋, 赵战勤. 2014-2017年河南省副猪嗜血杆菌分离菌株的PCR鉴定及分型[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1649-1657.
[10]	李志强, 闫书平, 纪晓霞, 王凯, 张源淑. 血管紧张素转换酶2在仔猪空肠中的分布表达及其与物质转运的关系[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1676-1684.
[11]	王昌英, 鹿红宇, 隋敏敏, 王岩超, 刘根, 孙亿, 姜运良. 猪SERPINC1基因对PCV2复制的效应及其转录调控[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1545-1553.
[12]	温东旭, 张雷, 索朗斯珠, 牛家强, 王玉恒, 贡嘎, 旦巴次仁, 席广银, 郭敏, 徐业芬. 牦牛Nramp1基因mRNA组织表达谱及其相关miRNAs初步研究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1576-1586.
[13]	胡永新, 赵永刚, 张永强, 刘拂晓, 樊晓旭, 吴晓东, 王志亮. 表达非洲猪瘟病毒P72蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1635-1641.
[14]	侯林杉, 贾敬亮, 顾文源, 刘宝京, 师乾凯, 袁广富, 陈少杰, 范京惠, 左玉柱. 基于猪丁型冠状病毒重组S1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1642-1648.
[15]	邱静静, 丁轲, 余祖华, 贾艳艳, 张春杰, 汪洋, 赵战勤. 2014-2017年河南省副猪嗜血杆菌分离菌株的PCR鉴定及分型[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1649-1657.