畜牧兽医学报 ›› 2015, Vol. 46 ›› Issue (10): 1775-1783.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2015.10.010
王坤1,2,张佰忠1,易康乐1,2,朱立军1,蒋隽2,燕海峰1,3*
WANG Kun1,2,ZHANG Bai-zhong1,YI Kang-le1,2,ZHU Li-jun1,JIANG Jun2,YAN Hai-feng1,3*
摘要:
旨在研究高效鸡囊胚细胞(Blastodermal cells,BCs)冷冻保存技术,为利用BCs保存禽类雌性遗传资源以及胚胎干细胞研究奠定基础。采用解冻后二乙酰荧光素 (Fluorescein diacetate,FDA)染色以及培养24 h后细胞贴壁率双重检测BCs活力方法,比较二甲基亚砜(DMSO)不同浓度、不同冷冻与解冻速率等对BCs的冷冻保存效果。结果表明:(1)DMSO不同浓度,20%组解冻后活力最高(0.58),与15%组差异不显著(P>0.05),但与5%、10%和25%组差异极显著(P<0.01);细胞复苏后贴壁率,20%组最高(30.5%),与15%组差异不显著(P>0.05),与25%组差异显著(P<0.05),与5%和10%组差异极显著(P<0.01)。(2)冷冻速率,使用三步法冷冻,以-1 ℃•min-1的速率降温至-7 ℃,保持10 min,继续降温分别至-15、-35、-55、-75 ℃后,投入液氮中保存,-75 ℃组解冻后活力最高(0.53),但与-35 ℃、-55 ℃组差异不显著(P>0.05);贴壁率,各组间差异极显著(P<0.01),其中-35 ℃组最高(36.6%)。(3)37 ℃水浴解冻,10 s、1 min、2 min、3 min解冻后,各组间活力差异不显著(P>0.05),其中10 s组最高(0.60),解冻后贴壁率,37 ℃水浴1 min组结果最好(43.9%),与水浴2 min组差异不显著(P>0.05),但与水浴10 s组差异显著(P<0.05),与水浴3 min组差异极显著(P<0.01)。50 ℃水浴5 s、20 s、40 s、1 min解冻,5 s组活力最高(0.70),与20 s组差异显著(P<0.05),与40 s、1 min组差异极显著(P<0.01),解冻后贴壁率,各组间差异均极显著(P<0.01),其中50 ℃水浴5 s 组最高(36.9%),50 ℃水浴 1 min 组最低(5.6%)。综上表明,鸡BCs使用DMSO浓度为20%的冷冻保护剂进行细管冷冻,以-1 ℃•min-1 的速率降温至-7 ℃保持10 min,继续以此速率降温至-35 ℃后,投入液氮保存,37 ℃水浴1~2 min 解冻,BCs 通过FDA染色与体外培养贴壁率双重检测均可获得较好效果。
中图分类号: