小RNA能在多水平（染色体构建、转录、翻译、RNA修饰和稳定等）对基因的表达进行调控。piRNA（Piwi－interacting RNA）主要参与生殖细胞的发育、转座子的沉默、异染色质的形成和生殖细胞DNA完整性的维持等过程，对遗传物质的稳定遗传具有重要意义。作为一类新型的小RNA，piRNA受到了广泛关注。从2006年发现至今，科研工作者对piRNA的发生和功能做了大量的推测、探索和验证。研究发现，piRNA主要分布在动物体睾丸的精原细胞和卵巢的卵母细胞内，果蝇卵巢体细胞（卵泡细胞）也存在少量的piRNA。piRNA在生殖细胞和体细胞内通过不同的途径产生，体细胞途径相对简单，生殖细胞途径主要通过“乒乓循环”实现。参与“乒乓循环”的3种Argonaute蛋白中，Piwi位于细胞核中，Ago3和Aub位于细胞质中，这一现象暗示piRNA可能在不同的区室内产生并发挥功能。piRNA 3′端的甲基化现象普遍存在，这对piRNA的稳定性具有重要意义，但并不是决定成熟piRNA长度的必需条件。piRNA相关蛋白质的已知功能是预测其产生过程和功能的重要线索，目前已有部分与piRNA产生和功能相关的蛋白质被发掘。另外，piRNA的调控网络比siRNA（Small interference RNA）和miRNA（microRNA）更加复杂，因此新的研究方法体系的出现加快了科研工作者对piRNA发生和功能的研究进程。本文主要就piRNA的生物发生、产生和功能相关蛋白及研究方法的研究进展做一简要论述。

病毒宏基因组学（Metagenomics）是一种新兴的病毒组学研究技术，它突破了传统技术方法的局限，而直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，可以快速地鉴定出环境中所有的病毒组成，从而是一种发现新病毒，监控病毒变异的分子流行病毒学研究的有力手段。在短短的几年里，人们用这种方法发现了很多有意义的病毒，并扩大了很多病毒的宿主范围，增强了人们对环境中包括各种媒介生物的病毒组成的了解，研究领域涉及到人类肠道、动物组织、血液、水体等，充分显示出其在病毒发现、病原溯源、微生物预警等方面的实用意义。笔者在本文中简要介绍了病毒宏基因组学的进展及应用前景。

为进一步了解猪LPL基因的结构和功能，本研究以苏钟猪为试验对象，利用实时荧光定量PCR方法，分析该基因在苏钟猪5种不同组织(心脏、肝脏、肾脏、皮下脂肪和背最长肌)中 RNA水平的表达谱信息；对苏钟猪LPL基因的CDS区域进行了克隆测序，并用生物信息学方法分析了苏钟猪LPL蛋白水平的结构和功能。结果表明：LPL基因在各组织中的mRNA表达丰度为：皮下脂肪>心脏>肾脏>背最长肌>肝脏，其中皮下脂肪的表达量显著高于其他组织(P<0.01)，且公猪背最长肌中的表达量显著高于母猪(P<0.01)，公猪与母猪间的眼肌面积和瘦肉率性状均差异显著(P<0.05)。猪LPL基因编码含479个氨基酸的蛋白，理论等电点为4.99，具有疏水性，存在信号肽，是分泌型蛋白，与牛、绵羊、家猫等的亲缘关系较近。LPL对苏钟猪的皮下脂肪、心脏、肾脏、肌肉等组织的脂肪沉积有重要影响，可成为苏钟猪肉质改良育种中的重要候选基因。

旨在研究可卡因苯丙胺调控转录肽（Cocaine amphetamine regulated transcript, CART）对促卵泡素(Follicular stimulating hormone, FSH)诱导的猪卵巢卵泡颗粒细胞雌激素产生的影响。用Long-term培养方法在不同CART、FSH浓度下对猪卵巢卵泡颗粒细胞培养7 d，在显微镜下观察各孔细胞生长情况并采集图像；采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定各孔雌激素浓度。细胞培养168 h后：（1）在培养液不添加CART时，添加FSH孔中的雌激素浓度与不添加孔相比，显著提高；浓度为25 ng·mL^-1时，雌激素浓度最高，为(17 295.57±184.03) pg·mL^-1；（2）CART对体外培养的无FSH和FSH为5 ng·mL^-1的猪卵巢卵泡颗粒细胞雌激素的产生没有影响；（3）当培养体系FSH浓度分别为25 和50 ng·mL^-1时，随着CART浓度的升高（0.01、0.1、1 μmol·L^-1），培养液雌激素浓度有下降的趋势，但各组间差异不显著（P>0.05）。但是，当FSH 为25 ng·mL^-1，CART为 0.1和1 μmol·L^-1时，与对照组相比，颗粒细胞雌激素的产生明显受到抑制（P<0.05）。但是，统计分析FSH和CART互作效应并不显著（P>0.05），这一点需进一步试验证明；（4）当培养液添加50 ng·mL^-1FSH时，随着CART浓度的升高（0.01、0.1、1 μmol·L^-1），与对照组相比，雌激素浓度各组差异不显著（P>0.05）。猪卵巢卵泡颗粒细胞雌激素的产生需在FSH诱导下进行；当培养液FSH为25和50 ng·mL^-1时，CART对FSH诱导的猪卵巢卵泡颗粒细胞雌激素的产生有抑制作用，但抑制效果并不显著。由此推断，并不像单胎的牛、羊，CART在猪卵泡发育过程中，可能并非是个主要的局部负调控因子。

旨在利用全基因组关联分析（GWAS）方法挖掘畜禽各种经济性状相关候选基因及分子标记。本试验利用鸡的60 K SNP芯片，对北京油鸡初生、28、56、80和100日龄体质量进行 GWAS研究。结果表明，共有9个SNPs位点达5%全基因组显著水平，与28或100日龄体质量显著相关，在这些显著位点附近包括LYRM1、LDB2等基因；还有96个SNPs位点达全基因组潜在显著水平，与检测的各个日龄体质量有潜在相关性。这些候选基因和分子标记的揭示为分子标记辅助选择技术的发展积累了素材。

为了研究miR-184及miR-205在绵羊毛囊发育过程中的作用，本研究以绵羊为研究材料，检测了miR-184及miR-205在毛囊3个发育时期及不同组织中的表达情况，进行了基因组定位及前体预测，并预测了可能的靶基因及调控的基因通路。结果发现，miR-184的表达量从毛囊生长期到衰退期呈逐步上升的趋势，而miR-205则表现为先上升后下降，其在衰退期表达量最高。2个microRNA在绵羊的多个组织中均有表达。两者的候选靶基因涉及15个基因通路，可能通过Wnt通路调控毛囊的生长周期。

旨在了解南方中国荷斯坦牛测定日产奶量、乳脂率、乳蛋白率和体细胞评分（Somatic cell score，SCS）变化趋势，并进行准确预测。利用Wood模型对南方5个大中型奶牛场(20082010年1～3胎)中国荷斯坦牛的33 194条测定日产奶量、乳脂率、乳蛋白率和SCS数据进行曲线拟合。结果表明，测定日产奶量为标准泌乳曲线，乳脂率、乳蛋白率和SCS变化与标准泌乳曲线正好相反。Wood模型对乳蛋白率和产奶量变化曲线拟合度最高，各胎次拟合度均为0.99，误差均方也较低；其次为乳脂率，各胎次拟合度均为0.98，而对SCS的拟合度最低，均在0.7以下，同时误差均方也最大。各胎次产奶高峰日出现的时间与乳蛋白率和SCS最低值出现的时间相近，而最低乳脂率出现的时间较晚。一胎牛高峰产奶量相对较低（30.4 kg·d^-1），但泌乳后期泌乳持续力及维持低SCS能力较强；二胎和三胎牛高峰产奶量较大，分别为35.9和36.2 kg·d^-1，二胎奶牛在泌乳后期同时维持高乳脂率和乳蛋白率的能力较强。Wood模型适合于南方中国荷斯坦牛测定日产奶量、乳脂率、乳蛋白率变化曲线的拟合分析，而不适合于SCS的拟合分析。

本试验通过比较2种微生物标记物¹⁵N和嘌呤（Purine bases, PB）估测肉羊瘤胃微生物N产量的效果，旨在建立不同方法之间的内在联系，为准确地估测肉羊微生物N提供依据。试验选用12只平均体质量为(41.3±2.8) kg的杜寒杂交(杜泊羊×小尾寒羊杂交)绵羊公羔，随机均分为3组，按照自由采食、自由采食量的70%和40%3个干物质采食水平饲喂，试验共持续25 d，其中预试期10 d，正试期15 d，最后5 d采集瘤胃食糜和十二指肠食糜并测定¹⁵N和PB。结果表明,瘤胃细菌成分（氮含量、嘌呤含量和嘌呤/氮）不受日粮处理的影响 (P>0.05)；十二指肠干物质、有机物、非氨氮和嘌呤流量均随日粮饲喂水平的降低显著下降（P<0.05）；应用¹⁵N和PB计算得到的微生物N产量均随日粮饲喂水平的降低而显著降低（P<0.05），计算得出的微生物合成效率则均不受日粮处理的显著影响（P>0.05)。¹⁵N测定的微生物N在各处理内的变异性要小于PB测定得到的微生物N，因此应用¹⁵N来测定微生物N能够得到更为准确可靠的结果。

为研究鲁中地区猪高热性疾病的病理变化及主要发病原因，对2011年1月-2012年3月患高热性疾病的56个患病猪群109头病猪进行了临诊症状及剖检病变观察，并对发病猪群进行追踪调查，采集363份发病猪群的血清，用ELISA方法检测血清样品的CSFV、PRRSV及PCV2抗体，用RTPCR和PCR方法检测病料中这3种病原，并对病料进行病理组织学及免疫组化检测。结果显示：患高热性疾病的猪群均已免疫过CSF、部分免疫过PRRS弱毒活疫苗，但均未进行PCVD疫苗免疫；发病猪群的CSF、PRRS及PCV2均有较高的抗体阳性率；病猪以淋巴组织急性炎症、间质性肺炎、病毒性脑炎的病变为主，其病变率分别为92.3%、76.1%和66.1%；CSFV、PRRSV和PCV2的病原检出率分别为30.27%、66.97%、41.28%，其中CSFV与PRRSV、CSFV与PCV2、PRRSV与PCV2二重感染检出率分别为16.51%、6.42%、28.44%，三者共感染检出率为4.59%，8.26%的病料未检测到这3种病原，属其它病原感染所致。序列分析表明CSFV流行株正在向着远离猪瘟兔化弱毒疫苗的方向发展， PRRSV均为高致病性变异毒株， PCV2则为毒力较强的PCV2b型。CSFV、PRRSV、PCV2是目前导致鲁中地区猪高热性疾病的主要病原，其中以PRRSV变异强毒感染最为常见，共感染是导致重症型猪高热性疾病的主要原因，病例还多见支原体、副猪嗜血杆菌等细菌病继发感染的病变，故该区域猪高热性疾病为多病原混合感染所致。

原核表达狂犬病病毒的基质蛋白(M)，并以此作为包被抗原建立间接ELISA检测方法，与以狂犬病病毒磷蛋白(P)作为包被抗原建立的间接ELISA方法进行比较。根据GenBank中公布的狂犬病病毒LEP-Flury株M基因序列设计特异性引物并引入SmaⅠ和NotⅠ酶切位点，经RT-PCR扩增得到目的基因，连接pCR^®2.1载体，构建重组质粒pCR-RV-M，重组质粒用SmaⅠ和NotⅠ进行双酶切，酶切产物定向克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，构建重组表达载体pGEX-RV-M。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，使用IPTG诱导表达目的蛋白，SDS-PAGE分析表明蛋白表达量较大，且主要以可溶性的形式表达。亲和层析纯化目的蛋白，Western blot表明融合蛋白具有良好的反应原性，使用纯化的融合蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法并检测了95份血清，同时使用带有His标签的重组狂犬病病毒磷蛋白P（RV-His-P）建立的ELISA方法和商品化的ELISA试剂盒检测该血清。结果表明：与商品化的以全病毒作为包被抗原的ELISA检测试剂盒相比，使用重组P蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测方法具有更高的符合率，能够代替全病毒作为诊断抗原建立检测方法。

为了构建莫氏巴贝斯虫（Babesia motasi）裂殖子cDNA表达文库，从中筛选和鉴定功能基因，利用差速离心法从莫氏巴贝斯虫感染的红细胞中纯化裂殖子，提取总RNA并纯化mRNA。在合成的双链cDNA两端加上含EcoRⅠ和Hind Ⅲ定向接头后连接到λ SCREEN载体上。通过体外包装形成完整的噬菌体颗粒，并用之转染ER1647，构建莫氏巴贝斯虫裂殖子的cDNA表达文库。用莫氏巴贝斯虫阳性血清筛选cDNA文库，获得的阳性克隆，经过测序和Blast软件分析鉴定，然后利用末端快速扩增技术（RACE）对筛选到的功能基因片段进行全长扩增。结果表明构建的cDNA表达文库其初级库容量约为1.0×10⁶ PFU，扩增文库为3.5×10⁹ PFU；通过免疫学筛选，获得50个阳性克隆。测序和Blast分析后，鉴定出10个莫氏巴贝斯虫基因片段，RACE扩增获得了其中8个基因的全长。本试验构建的莫氏巴贝斯虫裂殖子的cDNA表达文库和筛选到的10个结构和功能基因，为研究巴贝斯虫生物学特性、筛选疫苗与诊断用抗原及药物靶位奠定了基础。

为研究鹅β-防御素1(AvBD1)的生物学特性以及初步尝试探寻其抗肠炎沙门菌的作用机理，利用RT-PCR方法从鹅骨髓组织中扩增到鹅AvBD1基因片段，并将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点上，构建重组表达质粒pGEX-goose AvBD1。将重组质粒转化大肠杆菌BL21，于37 ℃用IPTG诱导表达， SDS-PAGE电泳表明，重组鹅AvBD1蛋白在原核高效表达（相对分子质量约31 ku）。该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性与理化特性。结果显示，鹅AvBD1基因cDNA片段大小为198 bp，编码65个氨基酸残基。经相似性分析发现鹅AvBD1氨基酸序列与鸵鸟AvBD1氨基酸序列相似性最高，为77.1%，而且重组鹅AvBD1蛋白具有广谱的抗菌活性，对12种细菌(包括革兰阳性菌和革兰阴性菌)均具有抑菌作用。高盐离子浓度显著降低重组鹅AvBD1蛋白的抗菌活性，且该重组蛋白的溶血活性极低。试验表明，肠炎沙门菌确实会诱导鹅AvBD1基因在鹅骨髓组织中的表达，说明鹅AvBD1起到了抗肠炎沙门菌感染的作用，而这种作用有可能与TLR4介导的信号转导有关。

采用RT-PCR和LD-PCR技术克隆了5个鸭种（金定鸭、樱桃谷北京鸭、番鸭、绿头鸭和斑嘴鸭）CD8α基因编码区序列，结合GenBank中已有禽类（红色原鸡、北京油鸡、斑胸草雀和火鸡）的CD8α序列，采用Jmodeltest最适核苷酸替代模型筛查，使用DAMBE V4.5.2对核苷酸替换(转换/颠换)的饱和性进行检测；并采用最大似然法检测各位点承受的选择压力。测序结果表明，不同鸭种间仅发现少数点突变，其编码区序列相当保守；AIC信息量准则检验结果发现9种禽类CD8α基因的最优核苷酸替代模型为“GTR+G”，核苷酸替换的饱和性检测结果表明序列的核苷酸替换并未饱和；应用 MEGA 5.0 构建了禽类CD8α基因的系统发育关系树，不同禽类CD8α基因大致划分为 3类 ；“位点-特异”模型检测到7个受到正选择作用的位点，其中4个位于功能重要的区域。本研究成功地克隆了鸭CD8α基因编码区序列，并发现不同禽类CD8α基因在分子进化中是保守的，研究结果为进一步了解禽类CD8α基因进化历程、结构与功能变异提供理论依据。

为了研究家兔脑纹状体出血后一氧化氮合酶（NOS）活性和一氧化氮（NO）含量的变化及L-NNA和血塞通对其变化的影响，探讨NO在脑出血损伤中的作用机制及2种药物对脑神经元的保护作用。选取4月龄健康哈白兔56只，随机分为假手术对照组、模型组，脑纹状体出血血塞通治疗组及脑纹状体出血L-NNA治疗组，手术建立家兔脑出血模型，应用生化检测技术测定各组脑纹状体出血后不同时间出血侧纹状体NOS活性及NO含量。结果表明，模型组脑纹状体内NOS活性6 h开始升高，3 d达到高峰，随后逐渐下降，9 d时基本恢复至正常水平；2治疗组纹状体NOS活性在各时间点极显著或显著低于模型组（P<0.01或P<0.05），并且L-NNA在6 h～1 d时降低脑纹状体NOS活性的程度好于血塞通治疗组（P<0.05）；NO含量的变化与NOS活性的变化基本一致，二者成正相关；利用SABC免疫组织化学法方法检测各组脑纹状体神经型NOS（nNOS）阳性神经元，发现模型组纹状体nNOS阳性神经元密度增加，细胞着色加深，胞体截面积和最长突起长度变小，经过治疗后神经元密度降低，胞体截面积和最长突起长度显著改善（P<0.05）。结果提示：NO参与了脑出血损伤过程，高浓度的NO能发挥神经毒性作用损害脑组织；血塞通和L-NNA通过抑制NOS的活性，降低了脑纹状体NO的含量，对脑出血家兔的脑神经元具有明显的保护作用。

为探讨Toll 样受体9 (TLR9) 及相关炎症因子在脑损伤中的调节机制，采用免疫组织化学SP法对正常大鼠、感染大肠埃希菌大鼠和黄连解毒汤预防大鼠脑组织中的TLR9表达及相关因子的动态变化进行了研究。66只SD大鼠随机分为正常对照组（n=6，腹腔注射生理盐水0.5 mL·只^-1）、试验组［n=30，腹腔注射大肠埃希菌菌液0.5 mL·只^-1（2.4×10⁹ CFU· mL^-1）］、黄连解毒汤预防组［n=30，每只按12.6 mL·kg^-1剂量提前6 d灌服黄连解毒汤，处理当天再分别腹腔注射大肠埃希菌菌液0.5 mL·只^-1（2.4×10⁹ CFU· mL^-1）］。除对照组外，试验组和预防组又分6个小组，每小组5只大鼠。分别于处理后的3、6、9、12、18、24 h随机处死1小组试验组和预防组大鼠及1只对照组大鼠，免疫组化观察脑组织TLR9及相关因子的表达）。结果发现，TLR9在大鼠正常生理状态下有少量表达，感染大肠埃希菌后，TLR9的表达出现明显变化，且这种变化随着时间的推移而越发明显。在感染后3 h时TLR9表达量较正常生理状态下显著增加（P＜0.05），在6 h时开始显著增加，12 h时达到高峰，与对照组和试验组相比，均有极显著差异（P＜0.01）。预防组与对照组比较无统计学意义（P＞0.05）。该研究结果显示黄连解毒汤可通过抑制TLR9的表达对细菌所致的脑损伤产生保护作用。

为了进一步探讨射干地龙颗粒临床用药的安全性，首次通过无创方式对射干地龙颗粒开展了安全药理学研究。分别按体质量应用高剂量（2.0 g·kg^-1）、中剂量（1.0 g·kg^-1）、低剂量（0.5 g·kg^-1，相当于推荐剂量）的射干地龙颗粒和生理盐水对犬进行灌胃，并观察麻醉犬的平均动脉压、心率、体温、心电标准Ⅱ导联、呼吸频率、潮气量、血氧饱和度、呼吸曲线、尿液11项指标和尿液增质量等相关指标；同时对昆明系小鼠按照上述药物剂量进行灌胃，并观察小鼠的自主活动；通过以上指标的观测来说明药物对心血管系统、呼吸系统、泌尿系统和中枢神经系统的影响。结果表明，按照2.0 g·kg-1将射干地龙颗粒进行灌胃，对麻醉犬的心血管系统、呼吸系统和泌尿系统无显著影响；小鼠自主活动结果表明，小鼠活动的总路程和时间及各边、角的路程和时间组间差异不显著（P>0.05），且小鼠的一般行为活动、姿势、步态均表现正常，无肌颤、不安、奔跑、嘶叫、蜷缩竖毛等异常，说明在试验剂量范围内药物对小鼠的中枢神经系统不表现显著影响。结果表明，至少在0.5~2.0 g·kg^-1范围内给药，射干地龙颗粒对动物心血管系统、呼吸系统、泌尿系统及中枢神经系统均无明显影响，表明其不良反应小，是一种适合于临床应用的、较为安全的药物。

为了揭示热休克蛋白90基因（Heat shock protein 90，HSP90）在细胞冷应激反应过程中的时空表达特性。以东北野猪成纤维细胞为研究对象，采用实时荧光定量PCR 技术分析了4、15、25和32 ℃不同强度冷应激条件下细胞内HSP90 mRNA转录变化规律。结果表明，在低温处理过程中，HSP90 mRNA转录量在各温度均未见显著增加（P>0.05）；在冷应激的复温培养过程中，HSP90 mRNA转录量在4和15 ℃处理4 h后复温培养8 h内显著增加（P<0.05），峰值出现在6 h，在25和32 ℃处理4 h后复温培养8 h内均未见显著增加；细胞在4和15 ℃处理2、4、6和8 h后，复温培养4 h，HSP90 mRNA转录量随处理温度的降低和时间的延长而增加，在25和32 ℃处理2、4、6和8 h后，复温培养未能显著诱导HSP90 mRNA的转录。结果提示，冷应激诱导东北野猪成纤维细胞内HSP90 mRNA转录量的增加,不是发生在低温处理的应激阶段，而是发生在复温后的细胞应激阶段，温和冷应激（25～32 ℃）未能诱导复温后HSP90 mRNA转录量的显著增加，强度冷应激（4～15 ℃）诱导复温后HSP90 mRNA转录量的显著增加，且与冷应激的强度和时间成正比。

本研究旨在探讨济宁青山羊出生后发育过程中乳腺组织内雌激素受体α(ERα)和 孕激素受体(PR)免疫阳性细胞的分布及平均光密度和mRNA分子水平的表达规律。应用SP免疫组化法和图像分析方法检测ERα和PR在济宁青山羊乳腺内的分布；以GAPDH为内参基因，qRT-PCR方法检测 ERα和PR mRNA的相对表达量。结果表明, ERα和PR阳性染色主要见于乳腺组织内的血管内皮细胞、基质细胞和腺管上皮细胞的细胞核中，偶见胞浆阳性着色，180日龄在腺泡上皮细胞亦可见PR阳性表达；ERα和PR平均光密度自出生~性成熟期呈现逐渐上升的趋势，且性成熟期显著高于出生当天和初情期(P<0.05)，但与180日龄相比无显著差异(P>0.05)。qRTPCR结果显示，ERα mRNA的表达量自出生~性成熟期呈现逐渐上升趋势，性成熟期最高，极显著高于出生当天和初情期(P<0.01)，180日龄略有下降。PR mRNA表达量自出生当天~性成熟期较低且组间差异不显著(P>0.05)，180日龄的表达量最高且极显著高于其他的3组(P<0.01)。济宁青山羊出生后发育过程中，ERα对腺管伸长和上皮分化以及PR对腺管分支和腺泡发育起促进作用。

为探求新型鸡白痢鸡伤寒沙门菌快速检测技术，本研究首次利用多壁碳纳米管与离子液体［BMIM］PF₆修饰四通道丝网印刷碳电极，制成双重放大信号检测鸡白痢鸡伤寒沙门菌的酶免疫传感器。用原子力显微镜表征其表观形态，循环伏安法监测其电化学特性。结果表明，在优化的检测条件下，免疫电极对目标菌的线性响应范围为10³～10⁹ cfu·mL^－1，检出限为3.93×10² cfu·mL^－1（S/N=3），4 ℃放置28 d后，响应电流为初始值的90.15%，具有良好的稳定性、特异性、重现性和准确性。多壁碳纳米管与离子液体结合制备的鸡白痢鸡伤寒沙门菌酶免疫传感器实现了检测信号的双重放大，检测灵敏度高，离子液体有助于保持酶标抗体的活性，延长免疫电极的有效时间。依据该方法构建的酶免疫传感器为快速检测其它致病菌酶免疫传感器的研究提供了良好的参照模型。

本研究旨在建立多重Real-time PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病毒（PRV）和猪细小病毒(PPV)。根据GenBank数据库中PRRSV、PCV2、PRV、和PPV的核苷酸序列设计特异性引物和探针，通过优化反应条件，检测系列稀释的纯化阳性质粒，建立检测PRRSV、PCV2、PRV和PPV的单项和多重Real-time PCR方法。灵敏度和特异性试验结果表明，无论是单项和多重Real-time PCR 检测，该方法都具有高度特异性，与其它病原检测无明显交叉反应；对4种病毒的最低检测量为＜10¹拷贝或1 TCID₅₀，检测灵敏度比常规PCR高100倍。对40份临床样本进行检测，多重Real-time PCR检测结果和单项Real-time PCR检测结果完全一致。建立的同时检测PRRSV、PCV2、PRV和PPV的多重Real-time PCR方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能对样品进行定量检测等优点。