畜牧兽医学报

中国黑白花奶牛干扰素-τ成熟蛋白基因的克隆与序列分析及牛干扰素-τ的分类

张明;管晓斌;朱庆;刘学方;冯玉梅;赖松家

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 417-424. doi:

摘要 ( 1243 )

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通过PCR克隆测序首次测定了黑白花奶牛干扰素-τ成熟蛋白的完整基因序列（GenBank登录号：DQ680846、DQ680847），其CDS长度为519bp，编码含有172个氨基酸的牛干扰素-τ成熟蛋白。对所有牛干扰素-τ序列进行聚类分析，可将其聚为4类，发现了新的一类牛干扰素-τ（τ4）和6种新亚型（τ1e、τ3f、τ3g、τ3h、τ4a、τ4b）。DQ680846属于τ4类的一种亚型，标记为τ4a；DQ680847属于τ3类的一种亚型，标记为τ3f。各牛干扰素-τ基因核苷酸序列间的同源性在92.7%~99.8%之间，推导氨基酸序列间的同源性在88.5%~99.4%之间；τ4a、τ3f与其他牛干扰素-τ基因核苷酸序列间的同源性分别在94.0%~97.1%、92.9%~99.6%之间，推导氨基酸序列间的同源性分别在91.4%~96.0%、88.5%~99.4%之间。这一结果反应了牛干扰素-τ基因在进化过程中的高度保守性。二级结构预测发现牛干扰素-τ成熟蛋白是以5个α-螺旋（A-E螺旋）为基础构成的。Asn78、Cys1 、Cys29、Cys99、Cys139、Ile143、Lys160和C-末端的11个氨基酸为高度保守区，它们是维持牛干扰素-τ的结构和功能所必需的。

猪miR-206前体的克隆、表达及生物信息学分析

陈俭海;魏文娟;肖骁;谢胜松;冯阳;赵书红

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 425-431. doi:

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研究骨骼肌中表达的miRNAs对深入探明骨骼肌生长发育的调控机制具有十分重要的意义。本文采用比较基因组学与生物信息学相结合的方法，从猪骨骼肌中克隆了猪miR-206的前体（Precursor），对该miRNA前体的二级结构及与其它物种序列的同源性进行了分析。RT-PCR结果显示，该前体miRNA在猪大多数组织中均有表达，在骨骼肌中表达量最高。生物信息学分析表明miR-206前体序列在不同物种间具有较高的保守性

猪CTSD全长cDNA的克隆和表达分析

梅盈洁;李加琪;陈瑶生;李晓筠;朱良瑞;凌飞;王翀;张豪

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 432-436. doi:

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以人CTSD mRNA全长序列为基序，在db EST库中搜索同源性大于80％、重叠大于40个碱基的猪EST下载经Seqman软件装配后，利用RT-PCR扩增到猪CTSD基因部分cDNA序列。进一步通过RACE技术获得cDNA全长（GenBank收录号为DQ018727），包括93 bp 5’UTR区、706 bp 3’UTR区和1233 bp ORF，编码410个氨基酸残基。其编码区与人、鼠、牛、羊CTSD同源性分别为87.9％、78.2％、86.6％和85.0％，氨基酸序列与已测序的猪、人、鼠、、牛、羊氨基酸序列同源性分别为97.4%、86.6%、80.1%、86.0%、84.7%。疏水性分析和信号肽预测发现猪CTSD氨基酸序列存在至少7个疏水性区域，信号肽位点为第1-20个氨基酸残基。在NCBI进行Blast P搜索结果显示猪CTSD氨基酸结构中含有Asn（Asparagine，天门冬酰胺）结构域，与天冬氨酸蛋白酶3D结构同源性高达99.7％，具有真核生物天冬氨酸蛋白酶的典型结构。以猪多组织RNA池为模板，以1026 bp部分 cDNA序列作为杂交探针进行Northern杂交得到一条2000 bp左右特异条带，从而验证了RACE产物为全长cDNA并揭示该基因只有一个转录本。为了研究猪CTSD基因在体内表达的特点，采用半定量RT-PCR对CTSD基因在猪10个组织中的表达进行研究，结果表明在10个组织中均有表达，且表达量与β-actin内参接近。

二花脸猪和大白猪睾丸IGF-I和IGF-IR基因表达发育变化比较

李发弟;夏东;陈杰;赵茹茜

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 437-441. doi:

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为了研究生长轴激素对猪繁殖性能发育的影响，随机选取0、3、20、30、90、120、180日龄纯种二花脸公猪和大白公猪各4头，屠宰并采取睾丸组织样，以18S rRNA为内标，用相对定量RT-PCR法研究睾丸IGF-I和IGF-IR mRNA的表达及发育性变化。结果表明，二花脸猪与大白猪睾丸IGF-I mRNA表达的发育模式在30日龄前完全相同，即随着日龄的增加而显著增加 (P﹤0.01)；二花脸猪睾丸IGF- I mRNA相对表达量在30～180日龄无显著变化；大白猪睾丸IGF- I mRNA相对表达量在90日龄有所下降，而在120和180日龄又恢复到30日龄水平。二花脸猪睾丸IGF- I mRNA相对表达量显著高于大白猪 (P﹤0.05)。二花脸猪与大白猪睾丸IGF- IR mRNA表达的发育模式不同。二花脸猪睾丸IGF-IR mRNA相对表达量在90～120日龄呈显著下降趋势 (P﹤0.05)；大白猪IGF-IR mRNA相对表达量在0日龄较高，随后显著下降 (P﹤0.05)，并在观察期内持续保持较低水平。二花脸猪IGF- IR mRNA相对表达量显著高于大白猪 (P﹤0.05)。睾丸IGF-I mRNA和IGF-IR mRNA相对表达丰度呈显著正相关 (r=0.575, P<0.01)。结论： (1) 不同品种猪睾丸IGF-I和IGF-IR mRNA表达具有特定的发育模式； (2) 猪睾丸中IGF-I和IGF-IR mRNA的协同表达可能对猪繁殖性能的发育有重要调节作用。

3品种鹅Myostatin基因3′-调控区SNPs群体遗传学分析

杨凤萍;陈义权;李世平;李其松;王金玉

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 442-446. doi:

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利用已测得的鹅Myostatin基因3′-调控区核苷酸序列设计5对PCR-SSCP引物，对扬州鹅、皖西白鹅以及五龙鹅3品种家鹅该区域内单核苷酸多态性进行了分析，并探索了单核苷酸多态性与生产性能之间的关系。结果，检测到A→G（88位）和G→T（353位）2个单碱基突变位点。88位点处，E基因为优势基因，具有EE、EF两种基因型，以扬州鹅杂合子频率最高(0.55)，皖西白鹅30个个体仅有一例EF型；353位处，G基因为优势基因，具有GG、GH和HH3种基因型，3品种均具有较高的GG型、较低的HH型。屠体性能分析发现，EF基因型家鹅具有更高的屠体性能；扬州鹅、皖西白鹅GG型个体的腿肌重和腿肌率显著高于HH型个体（P﹤0.05），五龙鹅腿肌重、腿肌率具有GG型﹥GH型﹥HH型的趋势，但差异不显著(P﹥0.05)。

内蒙古绒山羊KAP基因与经济性状关系的研究

张亚妮;张恩平;吴迪;陈玉林

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 447-451. doi:

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以60只内蒙古绒山羊为研究对象，利用PCR-SSCP技术，选取KAP基因作为候选基因，并利用SPSS软件下的GLM程序分析了KAP基因与产绒量性状、体重性状和绒细度性状的关系。结果表明：产绒量性状上，S1位点的BB基因型和S2位点的BB基因型可以作为标记基因型;在体重性状上，S2位点的BB基因型和S3位点的AA基因型可以作为标记基因型，绒细度性状上，S5位点的BB基因型可以作为标记基因型。在体重和产绒量性状上S2位点的BB基因型，可以作为多性状标记辅助选择的标记位点。

云岭黑山羊BMPR-IB 基因部分编码区的克隆及多态性分析

李丽萍;称美玲;刘维全;高士争

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 452-457. doi:

摘要 ( 1366 )

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应用RT-PCR方法从云岭黑山羊卵巢组织克隆与产羔性状相关的BMPR-IB基因。结果表明，克隆的BMPR-IB基因扩增片段长467bp，扩增片段位于该基因编码区第497位碱基与第963碱基之间，与已报道的野生型山羊、绵羊、猪、人和鼠的BMPR-IB基因该编码区的同源性分别为99%、99%、92%、92%和87%；与野生型山羊相比，云岭黑山羊BMPR-IB基因第498位和第575位碱基存在多态性位点，其中第498位碱基由T突变为C，组成的密码仍编码天冬氨酸（Asp,D），为同义突变；第575位碱基由C突变为T，编码的氨基酸由脯氨酸（Pro,P）变为亮氨酸（Leu,L），为错义突变；BMPR-IB蛋白的二级结构在错义突变位点可能具有多种构象。本研究结果为深入研究BMPR-IB基因与云岭黑山羊产羔性状间的关系奠定了基础。

转EGFP基因山羊克隆胚的发育

郑月茂;刘凤军;安志兴;李向臣;赵晓娥;权富生;张涌

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 458-463. doi:

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本研究利用脂质体包裹含EGFP基因的质粒，并将之导入山羊乳腺上皮细胞，经G418筛选获得阳性细胞，以之作为核供体利用核移植技术构建转基因克隆胚。结果如下：用转基因山羊乳腺上皮细胞作为核供体，电融合法更适合构建转基因克隆胚。转基因山羊克隆胚体外培养最佳方案是用SOFaa培养液，在培养72 h 后加入10 ％的NGS。荧光显微镜下观察到转基因克隆胚中EGFP的表达，大部分克隆胚发育到816细胞以后的时期，绿色荧光蛋白才开始逐渐表达，随着发育时间的延长，绿色荧光蛋白的表达也逐渐增强。说明外源基因在胚胎早期发育阶段可以表达，绿色荧光蛋白基因可以作为报告基因来实现对外源基因整合及表达的监测。

反10, 顺12共轭亚油酸对肉仔鸡肉品质和相关酶活的影响

张广民;文杰;陈继兰;赵桂苹;郑麦青

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 464-470. doi:

摘要 ( 1308 )

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选择1d健康AA肉仔鸡288只, 研究不同水平反-10,顺-12 共轭亚油酸(t-10,c-12 CLA)对肉仔鸡生长性能、肉品质、相关激素和酶活性的影响。试验采用单因素随机设计，将试验鸡随机分成6组,每组6个重复，每个重复8只鸡，分别饲喂0、0.20％、0.40% 、0.60%、0.80%和1.00% t-10,c-12 CLA的玉米-豆粕型饲粮，试验期42d。结果表明，饲粮CLA对肉鸡全期采食量、胸肌率、腿肌率、胸肌均无显著影响（P> 0.05），但对日增重、饲料转化率和腹脂率有显著影响（P<0.05）。饲粮中添加 0.20, 0.40, 0.60, 0.80 or 1.00 % CLA 降低了腹脂率 (P<0.01), 添加 0.60% t-10, c-12 CLA 显著提高了ADG and F/G (P<0.05)；饲粮添加 0.20, 0.40, 0.60 or 1.00% CLA 显著降低胸肌肉色 b* 和剪切力(P<0.05), 而对腿肌没有影响；饲粮添加 0.20, 0.40, 0.60 or 1.00% CLA 增加了腹脂 MDH 活性，但降低了其它组织中 MDH活性 and 血清中leptin浓度 (P<0.01)。结论：饲粮t-10,c-12 CLA可提高肉仔鸡的饲料转化率和日增重，对肉品质剪切力和品尝有改善作用；CLA降低腹脂率，增加了肌内脂肪的含量，可能与leptin浓度和苹果酸脱氢酶活性有关。

二肽在仔猪小肠刷状缘膜囊中跨膜转运的动力学特点研究

代建国;李德发;朴香淑;陈洪亮;潘宝海

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 471-475. doi:

摘要 ( 2022 )

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为研究二肽在仔猪小肠刷状缘膜囊（Brush Border Membrane Vesicles, BBMV）中跨膜转运的动力学特点，采用同位素示踪及体外孵育技术，观察了几种不同条件下Gly-Pro的跨膜转运量。结果表明：（1）在有Na+和无Na+的条件下，Gly-Pro的转运均显著地受到Leu-Gly、Ala-His、Gly-Leu和His-Leu等二肽的显著抑制(P<0.01)，但不受甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺和L-蛋氨酸的影响；（2）仔猪小肠BBMV对Gly-Pro的转运呈现非线性关系，但是遵从Michaelis –Menten动力学方程，其Kt (亲合常数) 值为0.64 mmol/L，而Vmax为7.42 nmol/（min•mg）膜蛋白；（3）仔猪小肠BBMV对Gly-Pro的摄取是由于Gly-Pro直接进入BBMV内部的结果，而不是仅仅结合在BBMV上所引起。结果提示，Gly-Pro在仔猪小肠BBMV中的跨膜转运具有载体介导的转运特点。

猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

白兴华;冯力;陈建飞;时洪艳;孙东波;吴波平;高秀春

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 476-481. doi:

摘要 ( 884 )

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根据猪传染性胃肠炎病毒和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针，通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化，建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。同时对37份现地病料进行检测并与常规RT-PCR方法、TGEV抗原快速检测试剂盒比较。结果，该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/µL，且具有很好的特异性和重复性，而常规RT-PCR方法只能检测到1.53×103拷贝/µL。对现地病料的检测结果也表明该法比常规RT-PCR方法和TGEV抗原快速检测试剂盒（免疫层析法）的敏感性高。

表达猪瘟病毒石门株E0抗原的重组腺病毒构建及免疫性的初步研究

孙永科;杨玉艾;王养会;张彦明

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 482-487. doi:

摘要 ( 822 )

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应用PCR从pMD18-T-E0质粒中扩增编CSFV E0蛋白的基因片段，定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上，采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带CSFV E0基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E0，转染293细胞，成功包装出重组腺病毒pAd-E0，PCR证实E0基因已整合至腺病毒基因组中，Westernblot结果检测到重组病毒感染293细胞中E0蛋白的表达。重组病毒经腹腔途径免疫小鼠，结果2次免疫后产生明显的免疫应答，ELISA检测血清抗体滴度分别为1∶512和1∶10 240。本文成功构建了表达猪瘟病毒E0基因的非复制型重组腺病毒，该重组病毒免疫小鼠可产生较高的抗体滴度。

母源抗体对同源及异源禽网状内皮增生病病毒感染诱发免疫抑制的预防作用

孙淑红;崔治中;孙爱军;朱秀同

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 488-492. doi:

摘要 ( 841 )

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蛋用型海兰褐母鸡在用网状内皮增生病病毒（REV）细胞适应毒REV-C99（p30）免疫接种后，均在2W内产生REV特异性抗体。来自免疫种鸡的雏鸡在7日龄内100%(10/10)REV母源抗体阳性。分别在有母源抗体和没有母源抗体的1日龄鸡接种与疫苗株同源的低传代毒REV-C99（p3）或异源的REV中国野毒株HA9901(p5)，以此比较母源抗体对同源和异源REV病毒感染造成的免疫抑制的预防作用。结果表明，REV母源抗体能同等有效地预防同源和异源REV感染造成的对H5和H9禽流感灭活疫苗HI抗体反应的抑制作用。

禽病原性大肠杆菌tsh突变株的构建及分离株tsh基因的检测

陈祥;刘静;苗晓青;王晓泉;高崧;焦新安;刘秀梵

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 493-499. doi:

摘要 ( 2043 )

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运用基因重组方法将庆大霉素抗性基因 (gentamycin, GM)连接到PCR扩增的tsh两端区域产生的2个目的基因片段之间，并共同插入到pUC18载体的多克隆位点中，构建出带GM标志的载体pUC18-tshFRGM，从中切下此3个片段，再将之克隆到pMEG-375自杀性载体中，构建出自杀性载体pMEG375-tshFRGM，将突变载体转化到含tsh基因的受体APEC E037株中，根据同源重组原理，筛选出tsh基因缺失的E037突变株，命名为E037 (Δtsh)。E037和E037 (Δtsh)株的LD50分别为105.6CFU和109.0CFU，动物感染性试验表明E037 (Δtsh)株在内脏器官和血液中的感染能力和大肠杆菌病变程度均有了明显下降。在243株禽源分离株中，有167株为tsh+菌株，其中高致病株、中等致病株和低致病株分别为87.4% (146/167)、12.6% (21/167)和0% (0/167)；O1、O2和O78血清型的高致病株占所在血清型分离株的89.5%~100%，而其它血清型的高致病株仅占其它分离株的53.3%，差异极显著 (P<0.01)。结果显示tsh+株大多数为高致病性菌株，且其致病性与血清型的种类有一定的相关性，温度敏感性血凝素为APEC重要的致病因子。

载体介导的shRNA抑制猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖特性的研究

冶贵生;张彦明;徐浩

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 500-505. doi:

摘要 ( 832 )

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利用生物学软件分析猪瘟病毒基因组NS3基因，设计针对NS3基因不同位置的干扰序列，化学合成这些序列，然后退火连接为双链干扰片段，再定向克隆到干扰载体中，将酶切和序列测定鉴定正确的重组载体命名为pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3、pGene-NS3-Negative。重组干扰载体经纯化后转染PK-15细胞，并进行G418抗性筛选。克隆细胞扩大培养后，接种猪瘟病毒Shimen株，收集细胞的分别进行实时定量PCR和ELISA光吸收度分析。Real-time PCR分析表明：pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3转录产生的shRNA分子与对照细胞比较，均在一定程度上沉默了病毒的mRNA，抑制率约为63%、46%、49%。ELISA检测结果表明：转染pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3重组载体的PK-15细胞均在不同程度上抑制了猪瘟病毒粒子的增殖。

猪β-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其活性

姚清侠;曹毅;钱平;徐卓菲;何雁南;司有辉;陈焕春

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 506-512. doi:

摘要 ( 1656 )

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为了高效表达分泌型的猪β-干扰素，将去除信号肽的编码梅山猪β-干扰素成熟多肽基因（mPoIFNβ）插入酵母－大肠杆菌穿梭载体pPIC 9K，构建成分泌型重组表达载体pPIC 9K-mPoIFNβ。将以SalⅠ线性化的pPIC 9K-mPoIFNβ用化学方法(LiCl)，与鲑鱼精DNA (ssDNA)共转化入毕赤酵母菌株GS115，转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后获得阳性菌株，再经高浓度G418筛选到多拷贝菌株。以1%甲醇连续诱导4天，SDS-PAGE和Western blot检测结果表明：表达产物为22kD和26kD的混合物，在GS115中的表达量约为80mg/L，占分泌型总蛋白的29.4%–30.8％，表明猪β-干扰素基因在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。对表达产物进行理化分析发现，重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2)，对热(56℃)部分敏感，并能被特异性的抗猪β-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。以细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素抗病毒活性，在MDBK（牛肾细胞系）中表达的猪β-干扰素的抗VSV比活性达到2.0×106U/mg；对口蹄疫病毒在IBRS-2细胞中的增殖也有明显的抑制作用。

牛肉组织中玉米赤霉醇及相关物残留的气相色谱-质谱法测定

张伟;王建平;沈建忠;李晓薇

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 513-517. doi:

摘要 ( 1358 )

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本文建立了能够同时检测牛肉组织中玉米赤霉醇（又名α-玉米赤霉醇）及三种相关物（β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇）残留的气相色谱-质谱联用法。样品均质后，用甲醇提取样品中的待测物，浓缩，用水稀释后，乙酸乙酯萃取，浓缩。用氢氧化钾溶液溶解，正己烷去脂，调pH至4，乙醚萃取，氨基固相萃取柱净化，衍生化后，用气相色谱-质谱联用仪检测，外标法定量。α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇线性范围均为0.5~10.0 ng/mL，检测限均为1.0 ng/g，在添加5.0 ng/g时，回收率在71.5%~81.4%，变异系数在1.4%~5.0%。

神经肽Y阳性神经元在皖西白鹅小肠的分布

李福宝;蒋书东;方富贵;李梅清;王惠;马光成

畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 518-520. doi:

摘要 ( 676 )

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中国标准连	ISSN 0366-6964
续出版物号	CN 11-1985/S

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