外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白激活MAPK信号通路的分析

doi:doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.017

摘要/Abstract

摘要：

旨在深入探究外源性绵羊肺腺瘤病毒（exJSRV）囊膜蛋白（Env）的致病机制，通过组织病理学观察和免疫组织化学染色，检测病肺的病理特征以及Env、EGFR和MAPK信号通路中p-Erk1/2和p-p38的阳性表达区，通过Western blot检测Erk1/2和p38在病肺中的磷酸化水平。转染重组表达质粒pcDNA 4/myc-His /exJSRV-env到A549细胞中，通过Western blot检测Erk1/2和p38的磷酸化水平。通过CCK-8法检测转染重组表达质粒的A549细胞的增殖活力。免疫组化结果显示：JSRV Env蛋白主要表达于病肺组织的肺泡上皮细胞和肿瘤细胞，EGFR在病肺组织中过表达于肺泡上皮细胞，脱落的肿瘤细胞及间质细胞中，而在健康绵羊肺中只是少量表达于肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞中，p-Erk1/2和p-p38在病肺组织中主要表达于肺泡上皮细胞和肿瘤细胞，EGFR、p-Erk1/2和p-p38的阳性表达区均与Env蛋白的阳性表达区一致。Western blot结果显示：病肺中p-Erk1/2和p-p38的磷酸化水平均极显著高于健康肺组织，转染重组表达质粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env的A549细胞中p-Erk1/2和p-p38的表达量均极显著高于对照组细胞，说明exJSRV-env确实激活了A549细胞的MAPK通路。而CCK8结果显示：转染重组表达质粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env的A549细胞增殖活力显著高于对照组细胞，说明exJSRV-env可能是通过激活的EGFR/MAPK通路促进A549细胞的恶性增殖，进而促使肿瘤的发生。本研究为进一步探索绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的致病机制奠定了基础。

关键词: 外源性绵羊肺腺瘤病毒, 囊膜蛋白, MAPK信号转导通路, 细胞增殖

Abstract:

In order to explore the pathogenesis of exJSRV Env，by the means of the pathology observation and immunohistochemistry，we detected the pathological characteristics and the positive regions of Env，EGFR，p-Erk1/2 and p-p38 in OPA (ovine pulmonary adenomatosis) sheep lung.Then we detected the relative expressions of p-Erk1/2 and p-p38 in sheep lung and in A549 cells after transiently transfecting recombinant plasmid pcDNA4/myc-His/exJSRV-env by Western blot.Finally we detected the proliferation activity of the cells with recombinant plasmid by CCK-8.Immunohistochemistry results revealed that infected lung cells expressed Env in alveolar epithelial cells and tumor cells；EGFR in alveolar epithelial cells，tumor cells slipping off and interstitial cells but less expressed in alveolar epithelial cells and bronchial epithelial cells in normal sheep lung；p-Erk1/2 and p-p38 in alveolar epithelial cells and tumor cells.Western blot results showed that the activation of p-Erk and p-p38 in OPA sheep lung were higher than normal sheep lung.The relative expressions of p-Erk and p-p38 in the A549 cells with recombinant plasmid were higher than control cells.And CCK8 showed that the proliferation activity of the cells with recombinant plasmid were higher than the control cells.We conclude that exJSRV Env activated EGFR/MAPK signal transduction pathway in A549 cells，and possibly promoted the malignant cell proliferation by this pathway and tumorigenesis.We provide a platform for the pathogenesis of JSRV Env.

Key words: exJSRV, envelope protein, MAPK signal transduction pathway, cell proliferation

中图分类号:

S852.659.3

孙晓林，杜方原，刘淑英. 外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白激活MAPK信号通路的分析[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(8): 1658-1666.

SUN Xiao-lin，DU Fang-yuan，LIU Shu-ying. Recombinant Plasmid pcDNA4/myc-His/exJSRV-env Transiently Transfect A549 Cells and Detect the Activation of MAPK Signal Transduction Pathway[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2016, 47(8): 1658-1666.

参考文献

［1］PALMARINI M，FAN H.Retrovirus-induced ovine pulmonary adenocarcinoma，an animal model for lung cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2001，93(21)：1603-1614.
［2］HOFACRE A，FAN H.Jaagsiekte sheep retrovirus biology and oncogenesis［J］.Viruses，2010，2(12)：2618-2648.
［3］FAN H，PALMARINI M，DEMARTINI J C.Transformation and oncogenesis by jaagsiekte sheep retrovirus［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2003，275：139-177.
［4］WOOTTON S K，METZGER M J，HUDKINS K L，et al.Lung cancer induced in mice by the envelope protein of jaagsiekte sheep retrovirus(JSRV)closely resembles lung cancer in sheep infected with JSRV［J］.Retrovirology，2006，3：94.
［5］MCGEE-ESTRADA K，FAN H.In vivo and in vitro analysis of factor binding sites in jaagsiekte sheep retrovirus long terminal repeat enhancer sequences：roles of HNF-3，NF-1，and C/EBP for activity in lung epithelial cells［J］.J Virol，2006，80(1)：332-341.
［6］孔汉金，张克山，刘永杰，等.绵羊肺腺瘤病毒env基因致瘤机制［J］.中国人兽共患病学报，2013，29(5)：504-508.
KONG H J，ZHANG K S，LIU Y J，et al.Oncogenesis mechanism of env gene from Jaagsiekte sheep retrovirus［J］.Chinese Journal of Zoonoses，2013，29(5)：504-508.(in Chinese)
［7］LEROUX C，GIRARD N，COTTIN V，et al.Jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV)：from virus to lung cancer in sheep［J］.Vet Res，2007，38(2)：211-228.
［8］于敏，倪琛琛，刘善青，等.EGFR、pEGFR蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义［J］.安徽医科大学学报，2011，46（1）：57-60.
YU M，NI C C，LIU S Q，et al.Expressions of EGFR and pEGFR in non-small cell lung cancer and their clinical significance［J］.Acta Universitatis Medicinalis Anhui，2011，46（1）：57-60.(in Chinese)
［9］蒋璐.PKGⅡ对胃癌细胞由EGF/EGFR启动的信号转导和相关的生物学活动的影响［D］.镇江：江苏大学，2013.
JIANG L.Effect of PKG Ⅱ on EGF/EGFR-induced signal transduction and related biological activities in gastric cancer cells［D］.Zhenjiang：Jiangsu University， 2013.(in Chinese)
［10］徐艳清，廖爱军.p38 MAPK在肿瘤浸润转移中的作用［J］.现代医药卫生，2013，29（20）：3090-3092.
XU Y Q，LIAO A J.The role of p38 lightning in tumor infiltration［J］.Journal of Modern Medicine & Health，2013，29（20）：3090-3092.(in Chinese)
［11］梁佳，包翠芬，魏嘉，等.P38和ERK1/2在肝细胞癌中的表达及意义［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2009，18（2）：202-206.
LIANG J，BAO C F，WEI J，et al.Expression and significance of p38 and ERK1/2 in human heap to cellular carcinoma［J］.Chinese Journal of Histochemistry and Cytochemistry，2009，18（2）：202-206.(in Chinese)
［12］孙佳，王志军，曹平安，等.p38MAPK对肿瘤细胞ATM、ATR和p53信号通路的影响［J］.中华临床医师杂志(电子版)，2013，7（8）：3426-3430.
SUN J，WANG Z J，CAO P A，et al.Effects of p38MAPK towards ATM，ATR and P53 cell signaling patways［J］.Chinese Journal of Clinicians(Electronic Edition)，2013，7（8）：3426-3430.(in Chinese)
［13］MAEDA N，FU W，ORTIN A，et al.Roles of the Ras-MEK–mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase-Akt-mTOR pathways in Jaagsiekte sheep retrovirus-induced transformation of rodent fibroblast and epithelial cell lines［J］. J Virol，2005，79(7)：4440-4450.
［14］COUSENS C，ALLEAUME C，BIJSMANS E，et al.Jaagsiekte sheep retrovirus infection of lung slice cultures［J］. Retrovirology，2015，12：31.
［15］张亚坤，刘淑英.绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白致癌作用的研究进展［J］.中国兽医科学，2012，42（12）：1315-1320.
ZHANG Y K，LIU S Y.Advance in tumorigenesis of jaagsiekte sheep retrovirus’ envelope protein［J］.Chinese Veterinary Science，2012，42（12）：1315-1320.(in Chinese)
［16］刘畅，李磊，于立新，等.绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白及其TM亚基通过激活Akt诱导NIH 3T3细胞转化［J］.中国预防兽医学报，2014，36（8）：606-610.
LIU C，LI L，YU L X，et al.Jaagsiekte retrovirus envelope protein and its transmembrane subunit induced transformation of NIH 3T3 cells by activating Akt［J］.Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2014，36（8）：606-610.(in Chinese)
［17］刘畅，敖威华，李磊，等.绵羊肺腺瘤病毒致病机制研究进展［J］.动物医学进展，2015，36（1）：79-82.
LIU C，AO W H，LI L，et al.Progress of tumorigenic mechanisms of ovine pulmonary adenomatosis virus［J］. Progress in Veterinary Medicine，2015，36（1）：79-82.(in Chinese)
［18］LINNERTH-PETRIK N M，SANTRY L A，YU D L，et al.Adeno-associated virus vector mediated expression of an oncogenic retroviral envelope protein induces lung adenocarcinomas in immunocompetent mice［J］.PLoS One，2012，7(12)：e51400.
［19］KETAM S，JOHN F，BRION N，et al.Inhibition of p38 mitogen activated protein kinase increase LPS induced inhibition of apoptosis in neutrophils by activating extracellular signal regulated kinase［J］.Surgery，2001，130(2)：242-247.
［20］JOHNSON C，SANDERS K，FAN H，et al.Jaagsiekte sheep retrovirus transformation in Madin-Darby canine kidney epithelial cell three-dimensional culture［J］. J Virol，2010，84(10)：5379-5390.
［1］PALMARINI M，FAN H.Retrovirus-induced ovine pulmonary adenocarcinoma，an animal model for lung cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2001，93(21)：1603-1614.
［2］HOFACRE A，FAN H.Jaagsiekte sheep retrovirus biology and oncogenesis［J］.Viruses，2010，2(12)：2618-2648.
［3］FAN H，PALMARINI M，DEMARTINI J C.Transformation and oncogenesis by jaagsiekte sheep retrovirus［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2003，275：139-177.
［4］WOOTTON S K，METZGER M J，HUDKINS K L，et al.Lung cancer induced in mice by the envelope protein of jaagsiekte sheep retrovirus(JSRV)closely resembles lung cancer in sheep infected with JSRV［J］.Retrovirology，2006，3：94.
［5］MCGEE-ESTRADA K，FAN H.In vivo and in vitro analysis of factor binding sites in jaagsiekte sheep retrovirus long terminal repeat enhancer sequences：roles of HNF-3，NF-1，and C/EBP for activity in lung epithelial cells［J］.J Virol，2006，80(1)：332-341.
［6］孔汉金，张克山，刘永杰，等.绵羊肺腺瘤病毒env基因致瘤机制［J］.中国人兽共患病学报，2013，29(5)：504-508.
KONG H J，ZHANG K S，LIU Y J，et al.Oncogenesis mechanism of env gene from Jaagsiekte sheep retrovirus［J］.Chinese Journal of Zoonoses，2013，29(5)：504-508.(in Chinese)
［7］LEROUX C，GIRARD N，COTTIN V，et al.Jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV)：from virus to lung cancer in sheep［J］.Vet Res，2007，38(2)：211-228.
［8］于敏，倪琛琛，刘善青，等.EGFR、pEGFR蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义［J］.安徽医科大学学报，2011，46（1）：57-60.
YU M，NI C C，LIU S Q，et al.Expressions of EGFR and pEGFR in non-small cell lung cancer and their clinical significance［J］.Acta Universitatis Medicinalis Anhui，2011，46（1）：57-60.(in Chinese)
［9］蒋璐.PKGⅡ对胃癌细胞由EGF/EGFR启动的信号转导和相关的生物学活动的影响［D］.镇江：江苏大学，2013.
JIANG L.Effect of PKG Ⅱ on EGF/EGFR-induced signal transduction and related biological activities in gastric cancer cells［D］.Zhenjiang：Jiangsu University， 2013.(in Chinese)
［10］徐艳清，廖爱军.p38 MAPK在肿瘤浸润转移中的作用［J］.现代医药卫生，2013，29（20）：3090-3092.
XU Y Q，LIAO A J.The role of p38 lightning in tumor infiltration［J］.Journal of Modern Medicine & Health，2013，29（20）：3090-3092.(in Chinese)
［11］梁佳，包翠芬，魏嘉，等.P38和ERK1/2在肝细胞癌中的表达及意义［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2009，18（2）：202-206.
LIANG J，BAO C F，WEI J，et al.Expression and significance of p38 and ERK1/2 in human heap to cellular carcinoma［J］.Chinese Journal of Histochemistry and Cytochemistry，2009，18（2）：202-206.(in Chinese)
［12］孙佳，王志军，曹平安，等.p38MAPK对肿瘤细胞ATM、ATR和p53信号通路的影响［J］.中华临床医师杂志(电子版)，2013，7（8）：3426-3430.
SUN J，WANG Z J，CAO P A，et al.Effects of p38MAPK towards ATM，ATR and P53 cell signaling patways［J］.Chinese Journal of Clinicians(Electronic Edition)，2013，7（8）：3426-3430.(in Chinese)
［13］MAEDA N，FU W，ORTIN A，et al.Roles of the Ras-MEK–mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase-Akt-mTOR pathways in Jaagsiekte sheep retrovirus-induced transformation of rodent fibroblast and epithelial cell lines［J］. J Virol，2005，79(7)：4440-4450.
［14］COUSENS C，ALLEAUME C，BIJSMANS E，et al.Jaagsiekte sheep retrovirus infection of lung slice cultures［J］. Retrovirology，2015，12：31.
［15］张亚坤，刘淑英.绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白致癌作用的研究进展［J］.中国兽医科学，2012，42（12）：1315-1320.
ZHANG Y K，LIU S Y.Advance in tumorigenesis of jaagsiekte sheep retrovirus’ envelope protein［J］.Chinese Veterinary Science，2012，42（12）：1315-1320.(in Chinese)
［16］刘畅，李磊，于立新，等.绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白及其TM亚基通过激活Akt诱导NIH 3T3细胞转化［J］.中国预防兽医学报，2014，36（8）：606-610.
LIU C，LI L，YU L X，et al.Jaagsiekte retrovirus envelope protein and its transmembrane subunit induced transformation of NIH 3T3 cells by activating Akt［J］.Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2014，36（8）：606-610.(in Chinese)
［17］刘畅，敖威华，李磊，等.绵羊肺腺瘤病毒致病机制研究进展［J］.动物医学进展，2015，36（1）：79-82.
LIU C，AO W H，LI L，et al.Progress of tumorigenic mechanisms of ovine pulmonary adenomatosis virus［J］. Progress in Veterinary Medicine，2015，36（1）：79-82.(in Chinese)
［18］LINNERTH-PETRIK N M，SANTRY L A，YU D L，et al.Adeno-associated virus vector mediated expression of an oncogenic retroviral envelope protein induces lung adenocarcinomas in immunocompetent mice［J］.PLoS One，2012，7(12)：e51400.
［19］KETAM S，JOHN F，BRION N，et al.Inhibition of p38 mitogen activated protein kinase increase LPS induced inhibition of apoptosis in neutrophils by activating extracellular signal regulated kinase［J］.Surgery，2001，130(2)：242-247.
［20］JOHNSON C，SANDERS K，FAN H，et al.Jaagsiekte sheep retrovirus transformation in Madin-Darby canine kidney epithelial cell three-dimensional culture［J］. J Virol，2010，84(10)：5379-5390.

[1]	凌英会, 朱露, 吴昊, 陈青, 权青, 刘勇, 李文雍, 张运海. 山羊FST慢病毒载体构建及其对卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(9): 1888-1896.
[2]	方娟, 陈指龙, 黎陈, 张逢, 伍小松, 杨青. 猪伪狂犬病病毒感染对PK-15细胞增殖和热休克蛋白27、70和90表达的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(7): 1441-1448.
[3]	方娟, 陈指龙, 黎陈, 张逢, 伍小松, 杨青. 猪伪狂犬病病毒感染对PK-15细胞增殖和热休克蛋白27、70和90表达的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(7): 1441-1448.
[4]	江雅, 牛季琛, 倪慧, 韦冬妹, 周国栋, 曹瑞兵. 一种检测乙型脑炎病毒抗体阻断ELISA的建立及其初步应用[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(9): 1961-1968.
[5]	江雅, 牛季琛, 倪慧, 韦冬妹, 周国栋, 曹瑞兵. 一种检测乙型脑炎病毒抗体阻断ELISA的建立及其初步应用[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(9): 1961-1968.
[6]	赵娟, 徐斯日古楞, 李慧萍, 刘淑英. 绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白引起绵羊绒毛膜滋养层细胞的恶性转化[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(5): 1089-1095.
[7]	赵娟, 徐斯日古楞, 李慧萍, 刘淑英. 绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白引起绵羊绒毛膜滋养层细胞的恶性转化[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(5): 1089-1095.
[8]	余祖华, 丁轲, 郁川, 贾艳艳, 何雷, 廖成水, 李静, 张春杰, 李银聚, 吴庭才, 程相朝, 张梦珂, 邱静静, 罗俊. gga-miR-155对MDCC-MSB1细胞生物学行为的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(11): 2496-2504.
[9]	余祖华, 丁轲, 郁川, 贾艳艳, 何雷, 廖成水, 李静, 张春杰, 李银聚, 吴庭才, 程相朝, 张梦珂, 邱静静, 罗俊. gga-miR-155对MDCC-MSB1细胞生物学行为的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(11): 2496-2504.
[10]	王晓燕, 刘文超, 付礼胜, 高雪丽, 刘超男, 吕晓萍, 郑世民. 禽网状内皮组织增生病病毒感染SPF雏鸡血液淋巴细胞增殖功能及其细胞周期相关因子变化[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(1): 157-163.
[11]	王晓燕, 刘文超, 付礼胜, 高雪丽, 刘超男, 吕晓萍, 郑世民. 禽网状内皮组织增生病病毒感染SPF雏鸡血液淋巴细胞增殖功能及其细胞周期相关因子变化[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(1): 157-163.
[12]	蔡国栋, 孙凯, 项自来, 王玲, 邹辉, 顾建红, 袁燕, 刘学忠, 刘宗平, 卞建春. 玉米赤霉烯酮对小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(7): 1357-1364.
[13]	刘宽辉, 田卫军, 高珍珍, 候冉冉, 岳婵娟, 王德云, 刘家国, 武毅, 胡元亮. 硒化党参多糖和大蒜多糖协同增强鸡外周血淋巴细胞和新城疫疫苗的免疫功效[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(7): 1349-1356.
[14]	刘宽辉, 田卫军, 高珍珍, 候冉冉, 岳婵娟, 王德云, 刘家国, 武毅, 胡元亮. 硒化党参多糖和大蒜多糖协同增强鸡外周血淋巴细胞和新城疫疫苗的免疫功效[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(7): 1349-1356.
[15]	蔡国栋, 孙凯, 项自来, 王玲, 邹辉, 顾建红, 袁燕, 刘学忠, 刘宗平, 卞建春. 玉米赤霉烯酮对小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(7): 1357-1364.