牦牛轮状病毒VP6基因序列分析及RT-PCR检测方法的建立与应用

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.021

畜牧兽医学报 ›› 2016, Vol. 47 ›› Issue (7): 1465-1473.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.021

牦牛轮状病毒VP6基因序列分析及RT-PCR检测方法的建立与应用

周芳，岳华，张斌，李凡，陈曦，汤承*

（西南民族大学生命科学与技术学院/四川省教育厅重大动物疫病防控技术创新团队，成都 610041）

收稿日期:2016-01-21 出版日期:2016-07-23 发布日期:2016-07-21
通讯作者: 汤承，博士，教授，Tel/Fax：+86-28-85528276，E-mail：tangcheng101@163.com
作者简介:周芳(1990-)，女，黑龙江德都人，硕士生，主要从事动物病原分子生物学研究，E-mail：1103306587@qq.com
基金资助:
“十二五”科技支撑计划项目（2012BAD13B06）；四川省科技计划项目青年基金（2014JQ0044）

Establishment and Application of an RT-PCR Assay for Yak Rotavirus Based on the Sequence Analysis of Yak Rotavirus VP6 gene

ZHOU Fang，YUE Hua，ZHANG Bin，LI Fan，CHEN Xi，TANG Cheng^*

（College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities/ Innovative Research Team on Animal Epidemic Prevention and Control of Education Department of Sichuan，Chengdu 610041，China）

Received:2016-01-21 Online:2016-07-23 Published:2016-07-21

摘要/Abstract

摘要：

轮状病毒(rotavirus，RV)VP6基因是RV的主要分子检测靶点，但该基因的点突变会影响RV的分子检测。本试验的目的是在研究牦牛RV VP6基因遗传变异的基础上，建立检测牦牛RV的RT-PCR方法并应用于临床样本检测。采用Prime 5.0设计引物，从30个牦牛腹泻样本中扩增得到14个位于931—1 338 bp牦牛RV VP6基因片段。序列分析结果发现，与牛轮状病毒（bovine rotavirus，BRV）相比，牦牛RV VP6基因在931—1 110 bp间出现多处点突变，而在1 100—1 338 bp之间序列高度保守。据此设计检测引物，成功建立了检测牦牛RV的RT-PCR方法，具有良好的特异性和稳定性，只扩增出牦牛RV及BRV的特异片段，对其他无关病原无扩增；检测下限为0.45 pg•μL-1，灵敏性较好。所建立方法对牦牛RV的检出率明显优于现有检测BRV的RT-PCR方法，为牦牛RV病的诊断和流行病学调查提供了可靠的方法；对BRV的检出也与其他方法具有很好的符合率，也可以用于BRV的检测。对234份犊牦牛腹泻粪便样本的RV检出率：西藏为60.00%（36/60）、青海为95.00%（57/60）；四川为85.19%（46/54）；云南为90.00%（54/60），证明牦牛RV感染是当前导致犊牦牛腹泻的重要原因。

关键词: 牦牛, 轮状病毒, VP6基因, 点突变, RT-PCR

Abstract:

Rotavirus (RV) VP6 gene is the main target gene of molecular detection，but the gene point mutations affects the molecular detection of RV.The purpose of this experiment was to establish a detection method of yak RV by RT-PCR method which applied in clinical samples based on the study of genetic variation yak RV VP6.The fragments of yak RV VP6 ranged in 931-1 338 bp were obtained with the primers designed by Prime 5.0 software from 30 samples of yak diarrhea.Sequence analysis showed that，yak RV VP6 genes represented multiple point mutations in the section of 931-1110 bp compared with bovine rotavirus (BRV)，while the section between 1 100-1 338bp was highly conserved.According to this result，the assay has successfully established a method with good specificity and stability.The primer could amplify the specific fragment of yak RV and BRV，with no amplification of other unrelated pathogens.The detection limit of viral nucleic acid of the assays was 0.45 pg•μL-1.With a remarkable detection rate in yak RV，the RT-PCR method provided a useful tool for the diagnosis and epidemiological investigation of yak RV disease.Additionally，this method can also be used in BRV detection.The RV detection rate in 234 samples of yak diarrhea from different provinces were 60.00% in Tibet (36/60)，95.00% in Qinghai (57/60)，85.19% in Sichuan(46/54) and 90.00% in Yunnan (54/60)，respectively.The result shows that RV infection is an important cause of yak diarrhea.

Key words: yak, rotavirus, VP6 gene, point mutation, RT-PCR

中图分类号:

周芳，岳华，张斌，李凡，陈曦，汤承. 牦牛轮状病毒VP6基因序列分析及RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(7): 1465-1473.

ZHOU Fang，YUE Hua，ZHANG Bin，LI Fan，CHEN Xi，TANG Cheng. Establishment and Application of an RT-PCR Assay for Yak Rotavirus Based on the Sequence Analysis of Yak Rotavirus VP6 gene[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2016, 47(7): 1465-1473.

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牦牛轮状病毒VP6基因序列分析及RT-PCR检测方法的建立与应用

Establishment and Application of an RT-PCR Assay for Yak Rotavirus Based on the Sequence Analysis of Yak Rotavirus VP6 gene

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