兔胎儿成纤维细胞的分离培养和鉴定

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.025

摘要/Abstract

摘要：

本研究旨在建立稳定传代的兔胎儿成纤维细胞系及其鉴定方法。取配种后14~15 d的兔胎儿，0.25%胰酶消化胎儿皮肤获得兔胎儿成纤维细胞，体外传代培养；通过观察细胞形态、测定生长曲线、免疫荧光染色、核型分析等鉴定兔胎儿成纤维细胞，PCR扩增SRY基因鉴定2株细胞系性别。研究结果表明，兔胎儿成纤维细胞呈梭形，可在体外快速生长，符合“潜伏期-对数期-平台期”的生长规律；免疫荧光染色结果显示，波形蛋白与纤维连接蛋白染色为阳性，细胞角蛋白染色为阴性，表明兔胎儿成纤维细胞纯度高，活性好；染色体检测结果显示，在传至第5代时，80%的成纤维细胞核型正常，为2n=44，属正常范畴；PCR法检测的2株细胞系均来源于兔雄性胎儿。综上表明，本研究建立了兔胎儿成纤维细胞系体外培养、传代、鉴定及其性别鉴定方法，可为转基因兔、克隆兔、兔诱导性多能性干细胞等研究提供充足、可靠的成纤维细胞来源。

关键词: 兔胎儿成纤维细胞, 细胞分离, 培养, 鉴定

Abstract:

This research was conducted to establish the stable rabbit embryonic fibroblast cell lines and identification methods. Rabbit embryonic fibroblasts were isolated from 14-15 d rabbit fetus by trypsin enzyme digesting skin tissues, and passaged in vitro steadily. Morphology observation, growth curve measurement, immunofluorescence and karyotype analysis were applied to cell lines identification. The sex of 2 cell lines were determined by amplifying core sequence of rabbit SRY gene. The results showed that rabbit embryonic were spindle shaped and fibroblasts grew fast in vitro, conforming to the pattern of “latent phase-logarithmic growth phase-stagnate phase”. Immunofluorescence assay showed that vimentin and fibronectin staining were positive, while cytokeratin staining was negative, indicated the high purity and activity of rabbit embryonic fibroblast cells. The result of chromosome analysis showed that 80% ploidy of one cell lines maintained normal (2n=44) when cultured up to passage 5. For cell lines sexing, SRY-PCR analysis suggested the 2 determined cell lines were male. These results indicated that our research could be used to establish rabbit embryonic fibroblast cell lines and determine sex, providing adequate and reliable fibroblast cells for transgenesis, cloning and iPS rabbit research.

Key words: rabbit embryonic fibroblasts, isolation, culture, identification

中图分类号:

魏如雪，赵学明，郝海生，杜卫华，朱化彬. 兔胎儿成纤维细胞的分离培养和鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(6): 1272-1279.

WEI Ru-xue，ZHAO Xue-ming，HAO Hai-sheng，DU Wei-hua，ZHU Hua-bin. Isolation，Culture and Identification of Rabbit Embryonic Fibroblasts[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2016, 47(6): 1272-1279.

参考文献

［1］LIU J，LUO Y，ZHENG L，et al.Establishment and characterization of fetal fibroblast cell lines for generating human lysozyme transgenic goats by somatic cell nuclear transfer［J］.Transgenic Res，2013，22(5)：893-903.
［2］BALAJI S，KING A，MARSH E，et al.The role of interleukin-10 and hyaluronan in murine fetal fibroblast function in vitro：implications for recapitulating fetal regenerative wound healing［J］.PLoS One，2015，10(5)：e0124302.
［3］WANG X，WANG Y，ZHENG X，et al.Direct interaction between ras homolog enriched in brain and FK506 binding protein 38 in cashmere goat fetal fibroblast cells［J］.Asian-Austral J Anim Sci，2014，27(12)：1671-1677.
［4］洪霞芳.中国兔产业发展研究［D］.北京：北京林业大学，2011.
HONG X F.Study on the development of rabbit industry in China［D］.Beijing：Beijing Forestry University，2011.(in Chinese)
［5］HONDA A，HIROSE M，HATORI M，et al.Generation of induced pluripotent stem cells in rabbits：potential experimental models for human regenerative medicine［J］.J Biol Chem，2010，285(41)：31362-31369.
［6］GUO Y，ZHANG C S，LI S G，et al.RNAi-mediated stable silencing of HGPRT expression in rabbit fibroblasts and SCNT embryo production［J］.Prog Biochem Biophys，2009，36(7)：872-879.
［7］JIANG Y，KOU Z，WU T，et al.Xist deficiency and disorders of X-inactivation in rabbit embryonic stem cells can be rescued by transcription-factor-mediated conversion［J］.Stem Cells Dev，2014，23(19)：2283-2296.
［8］OSTEIL P，TAPPONNIER Y，MARKOSSIAN S，et al.Induced pluripotent stem cells derived from rabbits exhibit some characteristics of nave pluripotency［J］.Biol Open，2013，2(6)：613-628.
［9］李义书.兔类胚胎干细胞体外培养体系的优化与建立［D］.杨凌：西北农林科技大学，2008.
LI Y S.Optimization and establishment of an in vitro culture system for rabbit embryonic stem cell ［D］.Yangling：Northwest A&F University，2008.(in Chinese)
［10］郭志林.小鼠、兔和牛胚胎干细胞分离培养及其向神经样细胞的分化［D］.杨凌：西北农林科技大学，2008.
GUO Z L.Isolation，culture and in vitro neural-like cell differentiation of mouse，rabbit and bovine embryonic stem cells［D］.Yangling：Northwest A&F University，2008.(in Chinese)
［11］赖良学，郑瑞珍，秦鹏春，等.影响体外培养兔胚发育和兔类ES细胞分离的若干因素［J］.中国兽医学报，1996，16(1)：16-21.
LAI L X，ZHENG R Z，QIN P C，et al.Several factors affecting development of rabbit embryos in vitro and establishment of rabbit embryonic stem (ES) cell-like cell lines［J］.Chinese Journal of Veterinary Science，1996，16(1)：16-21.(in Chinese)
［12］MEHRABANI D，MAHBOOBI R，DIANATPOUR M，et al.Establishment，culture，and characterization of Guinea pig fetal fibroblast cell［J］.Vet Med Ints，2014，2014：510328.
［13］张艳丽，许丹，庞训胜，等.奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究［J］.南京农业大学学报，2010，33(1)：81-86.
ZHANG Y L，XU D，PANG X S，et al.In vitro culture diary goat fetal fibroblasts and gene transfection through liposome ［J］.Journal of Nanjing Agricultural University，2010，33(1)：81-86.(in Chinese)
［14］吕长荣.诱导成年牛皮肤成纤维细胞为多能性干细胞的研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2011.
LÜ C R.Generation of induced pluripotent stem cells from adult bovine dermal fibroblasts［D］.Yangling：Northwest A&F University，2011.(in Chinese)
［15］李扬，郭继彤，吴凯峰，等.牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养［J］.细胞生物学杂志，2002，24(4)：254-256.
LI Y，GUO J T，WU K F，et al.Dissociation and in vitro culture of bovine fibroblasts［J］.Chinese Journal of Cell Biology，2002，24(4)：254-256.(in Chinese)
［16］张怡，赵连三，汪成孝，等.人胚胎成纤维细胞与小鼠胚胎成纤维细胞生物学特性比较［J］.生物医学工程学杂志，2003，20(2)：251-254.
ZHANG Y，ZHAO L S，WANG C X，et al.The comparison of biologic character between mouse embryonic fibroblast and human embryonic fibroblast［J］.Journal of Biomedical Engineering，2003，20(2)：251-254.(in Chinese)
［17］吴镝，洪权，陈香美，等.利用逆转录病毒RNAi载体抑制心肌成纤维细胞分泌纤维连接蛋白［J］.中国科学(C辑：生命科学)，2004，34(4)：335-342.
WU D，HONG Q，CHEN X M，et al.Using retrovirus RNAi vector inhibit fiber connection proteins secretion by mycocardial fibroblasts［J］.Science in China Series C Life Sciences，2004，34(4)：335-342.(in Chinese)
［18］COULOMBE P A，WONG P.Cytoplasmic intermediate filaments revealed as dynamic and multipurpose scaffolds［J］.Nat Cell Biol，2004，6(8)：699-706.
［19］徐浩翔，闫言.波形蛋白表达和功能的研究进展［J］.北京大学学报(医学版)，2009，41(5)：605-607.
XU H X，YAN Y.Progress of research on the expression and function of vimentin［J］.Journal of Peking University (Health Sciences)，2009，41(5)：605-607.(in Chinese)
［20］HOWARD B H.Replicative senescence：considerations relating to the stability of heterochromatin domains［J］.Exp Gerontol，1996，31(1-2)：281-293.
［21］曹海峰，随刘才，季索菲，等.梅山猪胎儿成纤维细胞的分离培养及SRY-PCR法快速性别鉴定［J］.安徽农业大学学报，2011，38(6)：907-910.
CAO H F，SUI L C，JI S F，et al.Rapid sex identification by SRY-PCR of in vitro cultured Meishan pig fetal fibroblast ［J］.Journal of Anhui Agricultural University，2011，38(6)：907-910.(in Chinese)
［22］SABERIVAND A，AHSAN S.Sex determination of ovine embryos by SRY and amelogenin (AMEL) genes using maternal circulating cell free DNA［J］.Anim Reprod Sci，2016，164：9-13.
［23］ZHU H，LIN B，CHEN J，et al.Study of a simple and rapid PCR sex identification of bovine embryo［J］.J Anim Vet Adv，2012，11(11)：1847-1852.
［24］侯健，安晓荣，苟克勉，等.Sry-PCR法快速鉴定体外培养兔胎儿成纤维细胞系的性别［J］.农业生物技术学报，2001，9(2)：191-193.
HOU J，AN X R，GOU K M，et al.Rapid sex determination of cultured rabbit fetal fibroblast cell lines by Sry-PCR ［J］.Journal of Agricultural Biotechnology，2001，9(2)：191-193.(in Chinese)

[1]	康浩然, 刘重阳, 于勇, 张俊杰, 潘子豪, 姚火春. 2017-2018年我国部分地区牛支原体的分离鉴定及多位点序列分型[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(9): 1857-1863.
[2]	马玉俊, 张凯, 王磊, 张康, 张宏, 王学智, 李杰, 梁子敬, 张景艳, 李建喜. 白蚁肠道纤维素降解菌的分离和鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(9): 1951-1954.
[3]	牛凯, 程汝佳, 许冠龙, 冯宇, 孙石静, 范学政, 彭小薇, 朱良全, 秦玉明, 丁家波, 常维山, 蒋卉. 一株鹿源牛种布鲁菌的鉴定及全基因组分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1666-1675.
[4]	牛凯, 程汝佳, 许冠龙, 冯宇, 孙石静, 范学政, 彭小薇, 朱良全, 秦玉明, 丁家波, 常维山, 蒋卉. 一株鹿源牛种布鲁菌的鉴定及全基因组分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1666-1675.
[5]	刘琪, 史利军, 梁琳, 张玲玲, 袁维峰, 梁瑞英, 李金祥, 崔尚金. 一株猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及其VP2和NS1基因的变异分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(5): 1106-1112.
[6]	刘琪, 史利军, 梁琳, 张玲玲, 袁维峰, 梁瑞英, 李金祥, 崔尚金. 一株猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及其VP2和NS1基因的变异分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(5): 1106-1112.
[7]	吕天星, 李松建, 郝永清. 鉴别显色培养基在奶牛乳房炎病原菌快速鉴定中的应用[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(4): 851-860.
[8]	吕天星, 李松建, 郝永清. 鉴别显色培养基在奶牛乳房炎病原菌快速鉴定中的应用[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(4): 851-860.
[9]	张洁, 陈大勇, 赵娟, 王晓娟, 杨惠, 刘淑英. 绵羊绒毛膜滋养层细胞与子宫内膜腔上皮细胞共培养体系的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(3): 562-569.
[10]	李然, 汤承, 罗雪, 岳华. 一株牦牛源G6P[11]型牛轮状病毒的分离鉴定及部分基因的序列分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(3): 592-601.
[11]	杨振兴, 孟锦昕, 肖雷, 朱建波, 廖德芳, 高林, 李占鸿, 杨恒, 李华春. 流行性出血病病毒(EHDV)血清7型毒株在中国的首次分离与鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(3): 602-610.
[12]	张洁, 陈大勇, 赵娟, 王晓娟, 杨惠, 刘淑英. 绵羊绒毛膜滋养层细胞与子宫内膜腔上皮细胞共培养体系的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(3): 562-569.
[13]	李然, 汤承, 罗雪, 岳华. 一株牦牛源G6P[11]型牛轮状病毒的分离鉴定及部分基因的序列分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(3): 592-601.
[14]	杨振兴, 孟锦昕, 肖雷, 朱建波, 廖德芳, 高林, 李占鸿, 杨恒, 李华春. 流行性出血病病毒(EHDV)血清7型毒株在中国的首次分离与鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(3): 602-610.
[15]	赵国宏, 王世琴, 王芬, 王宏, 刁其玉, 韩向敏, 张乃锋. 湖羊育肥期饲粮添加酵母培养物对营养物质表观消化率及瘤胃发酵参数的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(10): 2156-2165.