狂犬病病毒单质粒拯救系统的建立及应用

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.014

畜牧兽医学报 ›› 2015, Vol. 46 ›› Issue (11): 2020-2024.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.014

狂犬病病毒单质粒拯救系统的建立及应用

孙玉章^1，5，何彪²，许运斌³，丛彦龙^4*，Karl-Klaus Conzelmann^5*

(1.中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032；2.军事医学科学院军事兽医研究所，长春 130122；3.浙江大学动物科学学院，杭州 310020；4.吉林大学动物医学学院，长春 130062；5.慕尼黑大学基因中心，慕尼黑 81377）

收稿日期:2015-01-25 出版日期:2015-11-23 发布日期:2015-11-20
通讯作者: 丛彦龙，E-mail：congyanlong1977@126.com；karl-klaus Conzelmann
作者简介:孙玉章(1985-)，男，山东寿光人，博士，主要从事分子病毒学研究，Tel：0532-87694317，E-mail：yuzhang.sun1985@hotmail.com
基金资助:
青岛市优秀人才引进计划（Q201402025）；国家留学基金委资助项目（CSC-LMU2011）；德国自然科学基金（DFG SFB870）

Generation of a Single Infectious RABV cDNA Clone by Inserting IRES Sequences

SUN Yu-zhang^1，5，HE Biao²，XU Yun-bin³，CONG Yan-long^4* ，CONZELMANN Karl-Klaus^5*

(1.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032，China；2.Military Veterinary Institute，Academy of Military Medicals Sciences，Changchun 130122，China；3.College of Animal Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310020，China；4.College of Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China；5.Gene Center，University of Munich，Munich 81377，Germany)

Received:2015-01-25 Online:2015-11-23 Published:2015-11-20

摘要/Abstract

摘要：

旨在建立一种针对狂犬病病毒SAD L16株单质粒拯救的反向遗传操作系统。根据全长cDNA感染性克隆pSAD-L16 N、P和L基因上游序列的不同，分别设计多对引物将EMCV IRES序列、PV IRES序列和TaV 2A序列分别克隆入pSAD-L16载体的相应位置中，构建成5个重组狂犬病病毒全长cDNA克隆。在无需辅助质粒的情况下直接转染BSR T7/5细胞拯救病毒，并对拯救病毒进行生物学特性的鉴定和分析。结果表明，只有pSAD-NeNePeL和pSAD-NeNtPeL能够成功拯救出重组狂犬病病毒，获救病毒均高度致弱且增殖缓慢。获救的2株重组狂犬病病毒具有不同的遗传稳定性，表现出与野生型亲本毒株较大的差异。本研究首次建立起一种针对狂犬病病毒的单质粒拯救系统，为深入研究狂犬病病毒基因组结构与功能、分子致病机制以及狂犬病病毒与宿主相互作用等提供了一个基础的技术平台。

关键词: 狂犬病病毒, 单质粒拯救, 反向遗传学

Abstract:

In order to assess the possibility of developing one-plasmid rescue systems of rabies virus(RABV)，this study was undertaken to generate a single-infectious cDNA clone by inserting Picornaviral IRES elements.Five full-length cDNA clones were constructed by inserting encephalomyocarditis virus(EMCV) IRES sequences，PV IRES sequences or TaV 2A-like sequences to upstream of the respective ORFs.BSR T7/5 cells in 6-well plates were directly transfected with 10 μg of either full-length clones or co-transfected with pTiT-N，pTiT-P or pTiT-L using CaPO₄as the control.Two recombinant RABVs were successfully rescued from these constructs，yet the rescue of SAD-NeNePeL was significantly more efficient than the rescue of SAD-NeNtPeL.Passaged SAD-NeNtPeL was genetic stable whereas passaged SAD-NeNePeL was recombinant in the RNA level.Both viruses were strongly attenuated，only growing to titers reduced about 2-log steps in comparison to the wild-type virus，SAD L16 strain.The rescue of RABVs from these single infectious cDNA clones provide a powerful tool to investigate the molecular biology，neurotropism，and pathogenicity of RABV.

Key words: rabies virus, single infectious cDNA, reverse genetics system

中图分类号:

S852.659.5

孙玉章，何彪，许运斌，丛彦龙，Karl-Klaus Conzelmann. 狂犬病病毒单质粒拯救系统的建立及应用[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(11): 2020-2024.

SUN Yu-zhang，HE Biao，XU Yun-bin，CONG Yan-long，CONZELMANN Karl-Klaus. Generation of a Single Infectious RABV cDNA Clone by Inserting IRES Sequences[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2015, 46(11): 2020-2024.

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狂犬病病毒单质粒拯救系统的建立及应用

Generation of a Single Infectious RABV cDNA Clone by Inserting IRES Sequences

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