关岭牛MyoD I基因启动子真核表达载体的构建及其在小鼠C2C12细胞中的表达

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.006

畜牧兽医学报 ›› 2015, Vol. 46 ›› Issue (5): 719-727.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.006

关岭牛MyoD I基因启动子真核表达载体的构建及其在小鼠C2C12细胞中的表达

桓聪聪^1，2，许厚强^2*，陈伟^1，2，陈祥²，赵佳福²，张雯²，周迪²，夏丹²

（1.贵州大学生命科学学院，贵阳 550025；2.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室/贵州大学动物科学学院/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵阳 550025）

收稿日期:2014-07-28 出版日期:2015-05-23 发布日期:2015-05-19
通讯作者: 许厚强，博士，教授，主要从事细胞分子生物学研究，E-mail：houqiang0524@yahoo.com
作者简介:桓聪聪（1989-），女，河南许昌人，硕士生，主要从事细胞分子生物学研究，E-mail: huancongcong@126.com
基金资助:
转基因生物新品种培育重大专项 (2013ZX08009-004)；黔科合重大专项(字［2013］6008号)；贵州省科技厅农业攻关项目(黔科合NY字［2012］3008号)；贵州大学研究生创新基金(研农2014021)

Construction of MyoD I Promoter Eukaryotic Expression Vector in Guanling Cattle and Its Expression in Mouse C2C12 Cells

HUAN Cong-cong^1，2，XU Hou-qiang^2* ，CHEN Wei^1，2，CHEN Xiang²，ZHAO Jia-fu²，ZHANG Wen²，ZHOU Di²，XIA Dan²

（1.College of Life Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region of Ministry of Education，College of Animal Science，Guizhou University/Guizhou Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction，Guiyang 550025，China）

Received:2014-07-28 Online:2015-05-23 Published:2015-05-19

摘要/Abstract

摘要：

本研究旨在探究关岭牛4个不同长度的MyoD I启动子的启动活性，初步确定该基因核心启动子位置。采用实时荧光定量PCR技术对关岭牛不同组织中MyoD I基因的相对表达量进行检测。以关岭牛血液DNA为模板，设计5'端加磷的引物，PCR扩增获得4个不同长度的关岭牛MyoD I启动子，定向精确替换pEGFP-N3载体的CMV启动子区，构建重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoD I。利用脂质体法将重组质粒瞬时转染小鼠C2C12细胞，依据小鼠C2C12细胞发光的强弱判断MyoD I启动子的启动活性。结果显示，MyoD I基因在关岭牛肌肉组织中表达量较高；目的片段成功替换pEGFP-N3载体的CMV区；重组质粒能在小鼠C2C12细胞中成功表达，细胞在激发光下发绿色荧光。本研究成功构建了重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoD I，4个启动子均具有启动活性，其中P₃启动子在小鼠C2C12细胞中表达量最高，初步推断P₃启动子为该基因的核心启动子。

关键词: MyoD I, 真核表达载体, C2C12细胞, 启动子, 基因表达量

Abstract:

The aim of this study was to analyze promoter activity of 4 different lengths MyoD I promoters in Guanling cattle and determine preliminarily the position of the core gene promoter.The relative expression quantity was detected in different tissues of Guanling cattle by real-time quantitative PCR.The DNA extracted from Guanling cattle blood was as a template and the phosphorylated 5'end PCR primers was designed to amplify 4 different lengths MyoD I promoters in Guanling cattle，ultimately accurately replaced the CMV region of pEGFP-N3 vector and got eukaryotic expression vector pEGFP-N3-MyoD I.Then the recombinant plasmid was transiently transfected into mouse C2C12 cells by liposome method.The aim was to verify promoter activity of MyoD I promoter by Luminous intensity of mouse C2C12 cells.The expression level of MyoD I gene was the highest in muscle，the fragment was inserted into an expression vector，the recombinant plasmid could be successfully expressed in mouse C2C12 cells with green fluorescence under the excitation light.In this study,eukaryotic expression vector pEGFP-N3-MyoD I is successfully constructed，4 promoters constructed show promoter activity，expression quantity of P₃ promoter is the highest，so P₃ promoter is regarded as the core promoter of MyoD I gene.

Key words: MyoD I, eukaryotic expression vector, C2C12 cell, promoter, relative expression quantity

中图分类号:

S823
S813.3

桓聪聪，许厚强，陈伟，陈祥，赵佳福，张雯，周迪，夏丹. 关岭牛MyoD I基因启动子真核表达载体的构建及其在小鼠C2C12细胞中的表达[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(5): 719-727.

HUAN Cong-cong，XU Hou-qiang，CHEN Wei，CHEN Xiang，ZHAO Jia-fu，ZHANG Wen，ZHOU Di，XIA Dan. Construction of MyoD I Promoter Eukaryotic Expression Vector in Guanling Cattle and Its Expression in Mouse C2C12 Cells[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2015, 46(5): 719-727.

参考文献

［1］SALVA M Z.Design of tissue-specific regulatory cassettes for high-level rAAV-mediated expression in skeletal and cardiac muscle［J］.Gene Therapy，2007，2：320-329.
［2］DU X H，GAN Q F，YUAN Z R，et al.Polymorphism of MyoD1 and Myf6 genes and associations with carcass and meat quality traits in beef cattle［J］.Genet Mol Res，2013，12（4）：6708-6717.
［3］KNE?EVI? D，ÐURKIN I，KUŠEC G，et al.Influence of C489T SNP at MYOD1 gene on carcass，meat quality traits and chemical composition of hybrid pigs［J］.Agric Conspect Sci，2013，78（3）：193-196.
［4］李硕，郝斐，梁浩，等.牛肌细胞生成素基因（MyoG）启动子的活性及组织特异性分析［J］.农业生物技术学报，2014，22（1）：87-93.
LI S，HAO P，LIANG H，et al.Activity and tissue- specific analysis of bovine（Bos） myogenin gene（MyoG） promoter［J］.Journal of Agricultural Biotechnology，2014，22（1）：87-93.（in Chinese）
［5］GALICIA-VÁZQUEZ G，DI MARCO S，LIAN X J，et al. Regulation of eukaryotic initiation factor 4 AII by MyoD during murine myogenic cell differentiation［J］.PLoS ONE，2014，9（1）：e87237.
［6］STEFANON B，SGORLON S，GUIATTI D，et al.Association analysis between single nucleotide polymorphisms in the promoter region of LEP，MYF6，MYOD1，OPN，SCD genes and carcass traits in heavy pigs［J］. Ita J Anim Sci，2013，12（1）：13.
［7］STUPKA R，CITEK J，SPRYSL M，et al.The impact of MYOG，MYF6 and MYOD1 genes on meat quality traits in crossbred pigs［J］. Afr J Biotechnol，2012，11（88）：15405-15409.
［8］BLUM R，VETHANTHAM V，BOWMAN C，et al.Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle：the role of MyoD1［J］.Genes Dev，2012，26（24）：2763-2779.
［9］HALL J K，BANKS G B，CHAMBERLAIN J S，et al.Prevention of muscle aging by myofiber-assdciated satellite cell transplantation［J］.Sci Transl Med，2010，2（57）：57.
［10］VAN DER MEER S F，JASPERS R T，JONES D A，et al.Time-course of changes in the myonuclear domain during denervation in young-adult and old rat gastrocnemius muscle［J］.Muscle Nerve，2011，43（2）：212-222.
［11］MALATESTA M，MEOLA G.Structral and function alterations of the cell nucleus in skeletal muscle wasing：the evidence in situ［J］.Eur J Histochem，2010，54（4）：44.
［12］ZHANG B T，YEUNG S S，LIU Y，et al.The effects of low frequency electrical stimulation on statellite on statellite cell activity in rat skeletal muscle during hindlimb suspension［J］.BMC Cell Biol，2010，18（11）：87.
［13］LI H，ZHU C，TAO Z，et al.MyoD and Myf6 gene expression patterns in skeletal muscle during embryonic and posthatch development in the domestic duck（Anas platyrhynchos domestica）［J］.J Anim Breed Genet，2014，131（3）：194-201.
［14］SOUMILLION A，ERKENS J H F.Genetic variation in the porcine myogenin gene locus［J］.Mamm Genome，1997，8：564-568.
［15］SZUHAI K，DE JONG D，LEUNG W Y，et al.Transactivating mutation of the MYOD1 gene is a frequent event in adult spindle cell rhabdomyosarcoma［J］.J Pathol，2014，232（3）：300-307.
［16］BOWLIN K M，EMBREE L J，GARRY M G，et al.Kbtbd5 is regulated by MyoD and restricted to the myogenic lineage［J］.Differentiation，2013，86（4-5）：184-191.
［17］KOHSAKA S，SHUKLA N，AMEUR N，et al.Acetyltransferase association and histone acetylation at the MyoD1 locus during myogenic differentiation［J］.FASEB J，2014，28（1）：946.
［18］AKIZAWA Y，KANNO H，KAWAMICHI Y，et al.Enhanced expression of myogenic differentiation factors and skeletal muscle proteins in human amnion-derived cells via the forced expression of MYOD1［J］.Brain Dev，2013，35（4）：349-355.
［19］BLUM R，DYNLACHT B D.The role of MyoD1 and histone modifications in the activation of muscle enhancers［J］.Epigenetics，2013，8（8）：778-784.
［20］黄萌，许尚忠，昝林森，等.牛MyoD1基因遗传变异及其对胴体性状的影响［J］.中国畜牧兽医，2007，34（9）：40-43.
HUANG M，XU S Z，ZAN L S，et al.Polymorphism with exon 3 of the cattle MyoD1 gene and their frequencies in carcass traits［J］.Chinese Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2007，34（9）：40- 43.（in Chinese）
［21］YAO Z Z，FONG A P，CAO Y，et al.Comparison of endogenous and overexpressed MyoD shows enhanced binding of physiologically bound sites［J］.Skeletal Muscle，2013，3（1）：1-9.
［22］王秋华，曹允考，李树峰.牛MyoG基因启动子的克隆及功能的初步分析［J］.畜牧兽医学报，2012，43（1）：37-43.
WANG Q H，CAO Y K，LI S F.Cloning and preliminary functional analysis of bovine MyoG promoter［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2012，43（1）：37-43.（in Chinese）
［23］田璐，许尚忠，岳文斌，等.MyoD基因对肉牛酮体性状影响的分析［J］.遗传，2007，29（3）：313-318.
TIAN L，XU S Z，YUE W B，et al.Relationship between genotypes at MyoD locus and carcass traits in cattle［J］.Hereditas，2007，29（3）：313-318.（in Chinese）
［24］李飞，许厚强，陈伟，等.关岭牛MyoD基因启动子报告质粒的构建及活性验证［J］.基因组学与应用生物学，2013，（4）：459-466.
LI F，XU H Q，CHEN W，et al.Verification of activity and construction of the report plasmid of MyoD I gene promoter in Guanling cattle［J］.Genomics and Applied Biology，2013，（4）：459-466.（in Chinese）
［25］杨丽华，白东义，高雅罕，等.蒙古马运动相关基因的表达量差异研究［J］.畜牧兽医学报，2013，44（12）：1900-1906.
YANG L H，BAI D Y，GAO Y H，et al.Characterization of exercise relevant genes in Mongolian horses［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2013，44（12）：1900-1906.（in Chinese）
［26］李蓓，何小龙，芒来.蒙古马突触融合蛋白17（STX17）基因多态性及在不同毛色皮肤组织中的表达分析［J］.畜牧兽医学报，2011，42（11）：1632-1637.
LI B，HE X L，MANG L.Analysis on polymorphism and expression in different coat color skin of syntaxin-17（SKX17） gene in Mongolian horse［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2011，42（11）：1632-1637.（in Chinese）
［27］黎静，周军，钟梅，等.真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-ZNF217的构建及表达［J］.南方医科大学学报，2010，30（2）：391-393.
LI J，ZHOU J，ZHONG M，et al.Construction and expression of the eukaryotic green fluorescent protein expression vector pEGFP-NI-ZNF217［J］.Journal of First Military Medical University，2010，30（2）：391-393.（in Chinese）
［28］VORONOVA A，COYNE E，AL MADHOUN A，et al.Hedgehog signaling regulates MyoD expression and activity［J］.Biol Chem，2013，288（6）：4389-4404.
［29］KOHSAKA S，SHUKLA N，AMEUR N，et al.Acetyl transferase association and histone acetylation at the Myod1 locus during myogenic differentiation［J］.FASEB J，2014，28（1）：946.
［30］赵广珍，贾青，张翠翠，等.猪MyoD1基因多态性与肉质性状的相关分析［J］.河北农业大学学报，2012，35（4）：90-99.
ZHAO G Z，JIA Q，ZHANG C C，et al.Relationship between polymorphism of MyoD1 and meat quality traits in pig［J］.Journal of Agticultural University of Hebei，2012，35（4）：90-99.（in Chinese）

[1]	王昌英, 鹿红宇, 隋敏敏, 王岩超, 刘根, 孙亿, 姜运良. 猪SERPINC1基因对PCV2复制的效应及其转录调控[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1545-1553.
[2]	杨涛, 许厚强, 陈伟, 周迪, 王圆圆, 朱晓锋. 牛MSTN启动子与MEF2C转录因子相互作用的研究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1567-1575.
[3]	杨涛, 许厚强, 陈伟, 周迪, 王圆圆, 朱晓锋. 牛MSTN启动子与MEF2C转录因子相互作用的研究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1567-1575.
[4]	王昌英, 鹿红宇, 隋敏敏, 王岩超, 刘根, 孙亿, 姜运良. 猪SERPINC1基因对PCV2复制的效应及其转录调控[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1545-1553.
[5]	宋鹏琰, 李佳丽, 苗艳平, 李相运, 周荣艳, 锡建中. 绵羊miR-150启动子的鉴定及生殖激素对其转录调控研究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(7): 1358-1366.
[6]	刘宗立, 陈涛, 杨丹丹, 崔景香, 李川皓, 曾勇庆, 陈伟. 猪Nrf2基因克隆、生物信息学分析及启动子区转录活性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(7): 1328-1339.
[7]	刘宗立, 陈涛, 杨丹丹, 崔景香, 李川皓, 曾勇庆, 陈伟. 猪Nrf2基因克隆、生物信息学分析及启动子区转录活性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(7): 1328-1339.
[8]	宋鹏琰, 李佳丽, 苗艳平, 李相运, 周荣艳, 锡建中. 绵羊miR-150启动子的鉴定及生殖激素对其转录调控研究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(7): 1358-1366.
[9]	李兰会, 杜小龙, 王麒, 葛琳涵, 张乐超, 李雪梅, 李祥龙. 水貂DCT基因5'UTR克隆分析与启动子活性探究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(3): 524-533.
[10]	李兰会, 杜小龙, 王麒, 葛琳涵, 张乐超, 李雪梅, 李祥龙. 水貂DCT基因5'UTR克隆分析与启动子活性探究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(3): 524-533.
[11]	杜小龙, 王麒, 张乐超, 葛琳涵, 刘小辉, 王涵, 李兰会, 李祥龙. 山羊DCT基因启动子区甲基化水平、SNP与毛色特征关系研究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(2): 271-279.
[12]	杜小龙, 王麒, 张乐超, 葛琳涵, 刘小辉, 王涵, 李兰会, 李祥龙. 山羊DCT基因启动子区甲基化水平、SNP与毛色特征关系研究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(2): 271-279.
[13]	胡慧艳, 贾青, 侯胜奎, 刘津, 张婧, 张伟峰, 锡建中. 猪StAR基因启动子区克隆及其转录活性研究[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(7): 1524-1532.
[14]	胡慧艳, 贾青, 侯胜奎, 刘津, 张婧, 张伟峰, 锡建中. 猪StAR基因启动子区克隆及其转录活性研究[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(7): 1524-1532.
[15]	刘小辉, 彭永东, 周荣艳, 张传生, 李祥龙. 坝上长尾鸡MITF基因核心启动子鉴定与分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(6): 1116-1123.

关岭牛MyoD I基因启动子真核表达载体的构建及其在小鼠C2C12细胞中的表达

Construction of MyoD I Promoter Eukaryotic Expression Vector in Guanling Cattle and Its Expression in Mouse C2C12 Cells

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