Plk1是真核生物中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为Polo样激酶家族的重要成员之一，对细胞周期具有重要的调控作用。通过磷酸化不同的特异性底物，Plk1具有促进中心体成熟及纺锤体两极分配，控制有丝分裂启动，促进染色体列队，促进胞质分裂等一系列作用。新近研究表明，Plk1还与DNA损伤应答、肿瘤形成、胚胎早期发育密切相关。本文就Plk1在细胞有丝分裂中发挥的一系列调控作用，DNA损伤发生时如何参与细胞阻滞的启动与逆转，促进DNA损伤修复，Plk1的表达异常与肿瘤发生的因果关系，以及Plk1在促进胚胎早期发育的应用前景等进行综述，以供相关研究参考。

Plk1是真核生物中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为Polo样激酶家族的重要成员之一，对细胞周期具有重要的调控作用。通过磷酸化不同的特异性底物，Plk1具有促进中心体成熟及纺锤体两极分配，控制有丝分裂启动，促进染色体列队，促进胞质分裂等一系列作用。新近研究表明，Plk1还与DNA损伤应答、肿瘤形成、胚胎早期发育密切相关。本文就Plk1在细胞有丝分裂中发挥的一系列调控作用，DNA损伤发生时如何参与细胞阻滞的启动与逆转，促进DNA损伤修复，Plk1的表达异常与肿瘤发生的因果关系，以及Plk1在促进胚胎早期发育的应用前景等进行综述，以供相关研究参考。

水孔蛋白（AQP）是主要内在蛋白（MIP）家族重要的组成成员之一。研究发现，寄生虫水孔蛋白不仅能够调节虫体的渗透稳态、参与营养物质的转运、排出代谢产物，还可以使抗寄生虫药物进入虫体，因而成为研制新型寄生虫疫苗和抗寄生虫药物的潜在靶点。因此，研究水孔蛋白的结构与功能对寄生虫病防治具有重大意义。作者通过综述寄生虫水孔蛋白的作用机制和结构特征，以期为抗寄生虫生物制剂的研发提供参考。

水孔蛋白（AQP）是主要内在蛋白（MIP）家族重要的组成成员之一。研究发现，寄生虫水孔蛋白不仅能够调节虫体的渗透稳态、参与营养物质的转运、排出代谢产物，还可以使抗寄生虫药物进入虫体，因而成为研制新型寄生虫疫苗和抗寄生虫药物的潜在靶点。因此，研究水孔蛋白的结构与功能对寄生虫病防治具有重大意义。作者通过综述寄生虫水孔蛋白的作用机制和结构特征，以期为抗寄生虫生物制剂的研发提供参考。

旨在研究绵羊Otx-2基因与绵羊繁殖的关系，从阿勒泰绵羊下丘脑组织中克隆Otx-2及MT1、KISS-1、GnRH基因CDs（Coding region）区部分序列，采用RT-PCR分析了这些基因在心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、大脑、小脑、子宫、垂体、松果体、下丘脑和甲状腺组织中的表达差异；进一步用实时荧光定量PCR方法分析繁殖期和繁殖间期绵羊下丘脑中这些基因在日间和夜间表达的变化规律。结果表明，Otx-2和KISS-1、MT1基因在各组织中均有不同程度的表达，其中Otx-2和KISS-1在下丘脑中的表达量较高。Otx-2基因与KISS-1和GnRH基因在繁殖期的表达量均高于繁殖间期的表达量，且均表现出夜间的表达量极显著高于日间表达量的相似表达规律，综上表明，Otx-2基因可能参与绵羊的季节性繁殖调控。

旨在研究绵羊Otx-2基因与绵羊繁殖的关系，从阿勒泰绵羊下丘脑组织中克隆Otx-2及MT1、KISS-1、GnRH基因CDs（Coding region）区部分序列，采用RT-PCR分析了这些基因在心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、大脑、小脑、子宫、垂体、松果体、下丘脑和甲状腺组织中的表达差异；进一步用实时荧光定量PCR方法分析繁殖期和繁殖间期绵羊下丘脑中这些基因在日间和夜间表达的变化规律。结果表明，Otx-2和KISS-1、MT1基因在各组织中均有不同程度的表达，其中Otx-2和KISS-1在下丘脑中的表达量较高。Otx-2基因与KISS-1和GnRH基因在繁殖期的表达量均高于繁殖间期的表达量，且均表现出夜间的表达量极显著高于日间表达量的相似表达规律，综上表明，Otx-2基因可能参与绵羊的季节性繁殖调控。

类转录激活因子效应物（Transcription activator-like effector，TALE）已经成为基因组编辑和基因转录调控的有效工具，在多个物种的基因组中实现特定位点的删除、插入和突变。针对绵羊成纤维细胞生长因子5（Fibroblast growth factor 5，FGF 5）基因起始密码子ATG位点，设计构建TALENs（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）。通过比较分析正常培养和基因组编辑处理的绵羊成纤维细胞，电转TALENs组合，Surveyor突变检测，筛选获得1对有效的TALENs。有限稀释细胞传代培养，PCR扩增FGF 5基因片段，经PAGE检测筛选发生突变的细胞，测序确认FGF 5基因ATG位点产生缺失突变细胞。获得具有编辑活性的TALENs，为该基因的定点编辑奠定基础。Surveyor检测和测序结果表明，在绵羊FGF 5基因ATG起始密码子上游104碱基位点，存在1个G/C单核苷酸多态。

类转录激活因子效应物（Transcription activator-like effector，TALE）已经成为基因组编辑和基因转录调控的有效工具，在多个物种的基因组中实现特定位点的删除、插入和突变。针对绵羊成纤维细胞生长因子5（Fibroblast growth factor 5，FGF 5）基因起始密码子ATG位点，设计构建TALENs（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）。通过比较分析正常培养和基因组编辑处理的绵羊成纤维细胞，电转TALENs组合，Surveyor突变检测，筛选获得1对有效的TALENs。有限稀释细胞传代培养，PCR扩增FGF 5基因片段，经PAGE检测筛选发生突变的细胞，测序确认FGF 5基因ATG位点产生缺失突变细胞。获得具有编辑活性的TALENs，为该基因的定点编辑奠定基础。Surveyor检测和测序结果表明，在绵羊FGF 5基因ATG起始密码子上游104碱基位点，存在1个G/C单核苷酸多态。

为探明附睾视黄酸结合蛋白5（Lcn 5）mRNA在公山羊体组织及不同月龄附睾中的表达特性，及其在睾丸、附睾和精子中的定位。采用实时荧光定量PCR方法检测18种组织和不同月龄附睾Lcn 5 mRNA表达规律；利用蛋白印迹技术对成年公羊睾丸和附睾Lcn 5蛋白表达进行定量分析；利用免疫组化技术对5月龄公羊睾丸和附睾Lcn 5进行定位，利用免疫荧光技术对精子Lcn 5进行定位。Lcn 5 mRNA在不同组织中均有表达，其中在性腺中的表达量最高，附睾头＞附睾尾＞附睾体＞睾丸；在5月龄前附睾的Lcn 5 mRNA表达量随月龄逐渐升高，5月龄时达到最高，随后又逐渐降低。Western blotting 结果显示，Lcn 5蛋白表达量：附睾头＞附睾尾＞附睾体＞睾丸，支持了Lcn 5 mRNA定量的结果。免疫组化结果显示，5月龄山羊在附睾管壁的柱状细胞、纤毛细胞检测到较强Lcn 5蛋白表达的阳性信号，附睾尾管腔检测到较强的阳性信号。在睾丸各级生精细胞中也检测到了微弱阳性信号。Lcn 5蛋白包裹在精子头部顶体帽上。Lcn 5在山羊附睾中高度表达，其表达具有时空特异性，推测其在精子成熟和维持正常生理功能方面发挥重要作用，其生物学功能需要进一步深入研究。

为探明附睾视黄酸结合蛋白5（Lcn 5）mRNA在公山羊体组织及不同月龄附睾中的表达特性，及其在睾丸、附睾和精子中的定位。采用实时荧光定量PCR方法检测18种组织和不同月龄附睾Lcn 5 mRNA表达规律；利用蛋白印迹技术对成年公羊睾丸和附睾Lcn 5蛋白表达进行定量分析；利用免疫组化技术对5月龄公羊睾丸和附睾Lcn 5进行定位，利用免疫荧光技术对精子Lcn 5进行定位。Lcn 5 mRNA在不同组织中均有表达，其中在性腺中的表达量最高，附睾头＞附睾尾＞附睾体＞睾丸；在5月龄前附睾的Lcn 5 mRNA表达量随月龄逐渐升高，5月龄时达到最高，随后又逐渐降低。Western blotting 结果显示，Lcn 5蛋白表达量：附睾头＞附睾尾＞附睾体＞睾丸，支持了Lcn 5 mRNA定量的结果。免疫组化结果显示，5月龄山羊在附睾管壁的柱状细胞、纤毛细胞检测到较强Lcn 5蛋白表达的阳性信号，附睾尾管腔检测到较强的阳性信号。在睾丸各级生精细胞中也检测到了微弱阳性信号。Lcn 5蛋白包裹在精子头部顶体帽上。Lcn 5在山羊附睾中高度表达，其表达具有时空特异性，推测其在精子成熟和维持正常生理功能方面发挥重要作用，其生物学功能需要进一步深入研究。

本研究旨在探究关岭牛4个不同长度的MyoD I启动子的启动活性，初步确定该基因核心启动子位置。采用实时荧光定量PCR技术对关岭牛不同组织中MyoD I基因的相对表达量进行检测。以关岭牛血液DNA为模板，设计5'端加磷的引物，PCR扩增获得4个不同长度的关岭牛MyoD I启动子，定向精确替换pEGFP-N3载体的CMV启动子区，构建重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoD I。利用脂质体法将重组质粒瞬时转染小鼠C2C12细胞，依据小鼠C2C12细胞发光的强弱判断MyoD I启动子的启动活性。结果显示，MyoD I基因在关岭牛肌肉组织中表达量较高；目的片段成功替换pEGFP-N3载体的CMV区；重组质粒能在小鼠C2C12细胞中成功表达，细胞在激发光下发绿色荧光。本研究成功构建了重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoD I，4个启动子均具有启动活性，其中P₃启动子在小鼠C2C12细胞中表达量最高，初步推断P₃启动子为该基因的核心启动子。

本研究旨在探究关岭牛4个不同长度的MyoD I启动子的启动活性，初步确定该基因核心启动子位置。采用实时荧光定量PCR技术对关岭牛不同组织中MyoD I基因的相对表达量进行检测。以关岭牛血液DNA为模板，设计5'端加磷的引物，PCR扩增获得4个不同长度的关岭牛MyoD I启动子，定向精确替换pEGFP-N3载体的CMV启动子区，构建重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoD I。利用脂质体法将重组质粒瞬时转染小鼠C2C12细胞，依据小鼠C2C12细胞发光的强弱判断MyoD I启动子的启动活性。结果显示，MyoD I基因在关岭牛肌肉组织中表达量较高；目的片段成功替换pEGFP-N3载体的CMV区；重组质粒能在小鼠C2C12细胞中成功表达，细胞在激发光下发绿色荧光。本研究成功构建了重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoD I，4个启动子均具有启动活性，其中P₃启动子在小鼠C2C12细胞中表达量最高，初步推断P₃启动子为该基因的核心启动子。

本研究克隆了麦洼牦牛天然免疫受体1～10基因的编码区，利用生物信息学工具分析基因特点，荧光定量PCR测定TLRs基因在不同组织中的表达量。序列比较分析结果表明，麦洼牦牛TLR基因与其他物种在核苷酸水平及氨基酸水平上均表现出很高的保守性。遗传进化方面，麦洼牦牛TLRs与牛和绵羊TLRs遗传进化距离最近，并与人、马、鼠TLRs等形成哺乳动物的一个分支，与鸡则形成遗传距离较远的一个分支。同时我们在进行系统发育分析时发现，TLR1、TLR6先聚为一小支，再与TLR10又聚为更紧密的一支，然后TLR1、2、6、10和TLR7、8、9分别聚集在两个单个的分支上，TLR其他成员各自成为一支。荧光定量结果表明，TLRs在麦洼牦牛各组织均有表达，但不同成员在不同组织的表达存在较大的差异。其中TLR2、TLR4和TLR6在脾表达量最高，在卵巢、小肠、肾、肝中有高表达，TLR1、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10在肾表达量最高，在肝、肾、脾等组织中高表达。综上所述，本研究的开展能为以后揭示TLRs在牦牛等高原模式动物分子免疫机制以及牦牛抗病育种奠定基础。

本研究克隆了麦洼牦牛天然免疫受体1～10基因的编码区，利用生物信息学工具分析基因特点，荧光定量PCR测定TLRs基因在不同组织中的表达量。序列比较分析结果表明，麦洼牦牛TLR基因与其他物种在核苷酸水平及氨基酸水平上均表现出很高的保守性。遗传进化方面，麦洼牦牛TLRs与牛和绵羊TLRs遗传进化距离最近，并与人、马、鼠TLRs等形成哺乳动物的一个分支，与鸡则形成遗传距离较远的一个分支。同时我们在进行系统发育分析时发现，TLR1、TLR6先聚为一小支，再与TLR10又聚为更紧密的一支，然后TLR1、2、6、10和TLR7、8、9分别聚集在两个单个的分支上，TLR其他成员各自成为一支。荧光定量结果表明，TLRs在麦洼牦牛各组织均有表达，但不同成员在不同组织的表达存在较大的差异。其中TLR2、TLR4和TLR6在脾表达量最高，在卵巢、小肠、肾、肝中有高表达，TLR1、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10在肾表达量最高，在肝、肾、脾等组织中高表达。综上所述，本研究的开展能为以后揭示TLRs在牦牛等高原模式动物分子免疫机制以及牦牛抗病育种奠定基础。

细胞冷应激反应是一个复杂的过程，它包括低温本身的应激阶段和复温后的应激阶段。本研究以牦牛卵巢颗粒细胞为研究对象，利用实时荧光定量PCR、Western blot技术，分析温和冷处理1、5 d及复温1、2、4、8及24 h条件下，细胞内CIRBP、HSP70及P53变化规律。结果显示，细胞在25 ℃培养5 d，然后通过复温至37 ℃，会影响细胞生理状态以及诱导细胞应激反应。 CIRBP的表达量在25 ℃温和冷处理第1天开始上升，并且在复温后24 h左右恢复到正常水平。HSP70的表达量在37 ℃复温培养后逐步上升，复温8 h出现峰值，随后下降。P53 mRNA表达水平在复温培养4 h出现峰值，随后下降，并且其在CIRBP及HSP70 mRNA高表达时，均有明显的下降。结果表明，低温会诱导细胞CIRBP mRNA和蛋白表达水平的上升；HSP70能够被冷应激后的复温诱导；CIRBP和HSP70都具有抗应激损害和细胞凋亡的作用。这些数据将为亚低温和复温在各种研究和治疗领域的应用提供参考。

细胞冷应激反应是一个复杂的过程，它包括低温本身的应激阶段和复温后的应激阶段。本研究以牦牛卵巢颗粒细胞为研究对象，利用实时荧光定量PCR、Western blot技术，分析温和冷处理1、5 d及复温1、2、4、8及24 h条件下，细胞内CIRBP、HSP70及P53变化规律。结果显示，细胞在25 ℃培养5 d，然后通过复温至37 ℃，会影响细胞生理状态以及诱导细胞应激反应。 CIRBP的表达量在25 ℃温和冷处理第1天开始上升，并且在复温后24 h左右恢复到正常水平。HSP70的表达量在37 ℃复温培养后逐步上升，复温8 h出现峰值，随后下降。P53 mRNA表达水平在复温培养4 h出现峰值，随后下降，并且其在CIRBP及HSP70 mRNA高表达时，均有明显的下降。结果表明，低温会诱导细胞CIRBP mRNA和蛋白表达水平的上升；HSP70能够被冷应激后的复温诱导；CIRBP和HSP70都具有抗应激损害和细胞凋亡的作用。这些数据将为亚低温和复温在各种研究和治疗领域的应用提供参考。

为了研究转化生长因子β3（Transforming growth factor beta3，TGF-β3）对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞表型的影响。本研究在体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞中添加不同浓度TGF-β3（6.25、12.5、25、50 ng•mL^-1），通过实时监测和检测细胞增殖、毛色相关基因小眼畸形相关转录因子（Microphthalmia—associtated transcription factor，MITF）、酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）和酪氨酸酶相关蛋白2（Tyrosinase related protein 2，TYRP2）表达以及黑色素产量的变化。结果表明：（1）在羊驼皮肤黑色素细胞中添加50 ng•mL^-1浓度的TGF-β3后，在前30 h内对细胞增殖有抑制效果，30 h后对细胞增殖有明显的长时程维持细胞数量作用，但对TGF-β3添加的剂量没有依赖性；（2）添加TGF-β3后，黑色素细胞内MITF、TYR和TYRP2的表达量均被下调，而且黑色素细胞产生黑色素的量也被下调，主要以添加50 ng•mL^-1时下调最为显著。结果揭示，TGF-β3通过对羊驼黑色素细胞内MITF、TYR和TYRP2的表达的影响，并调控黑色素的产生，对黑色素细胞的生物学功能具有重要的影响。

为了研究转化生长因子β3（Transforming growth factor beta3，TGF-β3）对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞表型的影响。本研究在体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞中添加不同浓度TGF-β3（6.25、12.5、25、50 ng•mL^-1），通过实时监测和检测细胞增殖、毛色相关基因小眼畸形相关转录因子（Microphthalmia—associtated transcription factor，MITF）、酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）和酪氨酸酶相关蛋白2（Tyrosinase related protein 2，TYRP2）表达以及黑色素产量的变化。结果表明：（1）在羊驼皮肤黑色素细胞中添加50 ng•mL^-1浓度的TGF-β3后，在前30 h内对细胞增殖有抑制效果，30 h后对细胞增殖有明显的长时程维持细胞数量作用，但对TGF-β3添加的剂量没有依赖性；（2）添加TGF-β3后，黑色素细胞内MITF、TYR和TYRP2的表达量均被下调，而且黑色素细胞产生黑色素的量也被下调，主要以添加50 ng•mL^-1时下调最为显著。结果揭示，TGF-β3通过对羊驼黑色素细胞内MITF、TYR和TYRP2的表达的影响，并调控黑色素的产生，对黑色素细胞的生物学功能具有重要的影响。

旨在探明美洲水貂黑素皮质激素受体-1（Melanocortin-1 receptor，MC1R）基因序列结构特征及其对皮毛颜色的调控机制。根据欧洲水貂MC1R基因（GenBank登录号：AB189820）核苷酸序列设计1对特异性引物，利用PCR及克隆技术测定美洲短毛黑水貂MC1R基因完整编码区序列（CDS），并对该序列进行了BLAST比对及生物信息学预测和分析。结果表明，获得的美洲水貂MC1R基因与欧洲水貂相似性为95%，为单一外显子基因，核苷酸序列长度为1 324 bp，包括部分5′UTR（188 bp）、CDS（954 bp）和3′UTR（182 bp），编码区碱基G+C含量高达66.04%，由CDS推导共编码317个氨基酸，预测的MC1R蛋白理论分子质量为34.49 ku，等电点（PI）为8.97，不稳定系数是36.63，属于弱碱性稳定蛋白质。进一步分析发现，美洲水貂MC1R基因编码的蛋白存在1个低复杂度结构域和7个典型的跨膜区，N-端不存在信号肽，定位于细胞质膜，具有典型的细胞膜受体结构。分子进化分析显示，美洲水貂与欧洲水貂亲缘关系较近，与二者均属鼬科、鼬属动物的传统动物分类学一致。美洲水貂MC1R基因的获取及序列结构特征分析为揭示其皮毛颜色多样性的分子遗传学机制奠定了详细的生物信息学基础。

旨在探明美洲水貂黑素皮质激素受体-1（Melanocortin-1 receptor，MC1R）基因序列结构特征及其对皮毛颜色的调控机制。根据欧洲水貂MC1R基因（GenBank登录号：AB189820）核苷酸序列设计1对特异性引物，利用PCR及克隆技术测定美洲短毛黑水貂MC1R基因完整编码区序列（CDS），并对该序列进行了BLAST比对及生物信息学预测和分析。结果表明，获得的美洲水貂MC1R基因与欧洲水貂相似性为95%，为单一外显子基因，核苷酸序列长度为1 324 bp，包括部分5′UTR（188 bp）、CDS（954 bp）和3′UTR（182 bp），编码区碱基G+C含量高达66.04%，由CDS推导共编码317个氨基酸，预测的MC1R蛋白理论分子质量为34.49 ku，等电点（PI）为8.97，不稳定系数是36.63，属于弱碱性稳定蛋白质。进一步分析发现，美洲水貂MC1R基因编码的蛋白存在1个低复杂度结构域和7个典型的跨膜区，N-端不存在信号肽，定位于细胞质膜，具有典型的细胞膜受体结构。分子进化分析显示，美洲水貂与欧洲水貂亲缘关系较近，与二者均属鼬科、鼬属动物的传统动物分类学一致。美洲水貂MC1R基因的获取及序列结构特征分析为揭示其皮毛颜色多样性的分子遗传学机制奠定了详细的生物信息学基础。

选用益生枯草芽孢杆菌研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素表达的调节作用。首先，在体外成功培养绵羊瘤胃上皮细胞，然后用枯草芽孢杆菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞进行不同浓度、不同时间的刺激，利用荧光定量PCR技术（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）从mRNA水平检测刺激后上皮细胞中绵羊β-防御素-1（Sheep beta-defensin-1，SBD-1）基因表达水平的差异。结果表明：当菌液浓度为10¹⁰ cfu•mL^-1刺激上皮细胞8 h后，SBD-1的表达量达到最高；不同的菌液浓度诱导下SBD-1的表达量均有显著增加，10⁹、10¹⁰、10¹¹ cfu•mL^-1菌液浓度刺激下，SBD-1的表达量与空白相比差异极显著（P<0.01）。结果表明，枯草芽孢杆菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1基因的表达。

选用益生枯草芽孢杆菌研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素表达的调节作用。首先，在体外成功培养绵羊瘤胃上皮细胞，然后用枯草芽孢杆菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞进行不同浓度、不同时间的刺激，利用荧光定量PCR技术（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）从mRNA水平检测刺激后上皮细胞中绵羊β-防御素-1（Sheep beta-defensin-1，SBD-1）基因表达水平的差异。结果表明：当菌液浓度为10¹⁰ cfu•mL^-1刺激上皮细胞8 h后，SBD-1的表达量达到最高；不同的菌液浓度诱导下SBD-1的表达量均有显著增加，10⁹、10¹⁰、10¹¹ cfu•mL^-1菌液浓度刺激下，SBD-1的表达量与空白相比差异极显著（P<0.01）。结果表明，枯草芽孢杆菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1基因的表达。

本研究通过测定大豆抗原β-Conglycinin酶解肽（52 ku）对仔猪空肠上皮细胞（IPEC）通透性及紧密连接蛋白Occludin与ZO-1 基因mRNA表达的影响，为探索其对肠道损伤的相关机制提供依据。本试验分别采用不同浓度（0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg•mL^-1）52 ku酶解肽处理IPEC 2、4、6、8、12、24 h后，通过测定细胞存活力（MTT值）、跨上皮细胞电阻值（TEER）以及细胞培养液中碱性磷酸酶（AP）的活性，检测52 ku酶解肽对细胞膜通透性的影响。并选取0.5 mg•mL^-1 52 ku酶解肽处理IPEC 24 h后，用实时荧光定量PCR方法检测Occludin与ZO-1基因 mRNA表达量的变化情况。结果表明，52 ku酶解肽处理仔猪空肠上皮细胞后，MTT值和TEER呈时间-剂量依赖性降低（P<0.05）。24 h处理后，AP活性呈显著升高趋势（P<0.05）。与对照组相比，52 ku酶解肽可使Occludin和ZO-1 基因mRNA相对表达量均呈显著下降趋势（P<0.05）。总之，52 ku酶解肽使仔猪空肠上皮细胞通透性增加，并降低Occludin 或ZO-1的 mRNA表达。

本研究通过测定大豆抗原β-Conglycinin酶解肽（52 ku）对仔猪空肠上皮细胞（IPEC）通透性及紧密连接蛋白Occludin与ZO-1 基因mRNA表达的影响，为探索其对肠道损伤的相关机制提供依据。本试验分别采用不同浓度（0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg•mL^-1）52 ku酶解肽处理IPEC 2、4、6、8、12、24 h后，通过测定细胞存活力（MTT值）、跨上皮细胞电阻值（TEER）以及细胞培养液中碱性磷酸酶（AP）的活性，检测52 ku酶解肽对细胞膜通透性的影响。并选取0.5 mg•mL^-1 52 ku酶解肽处理IPEC 24 h后，用实时荧光定量PCR方法检测Occludin与ZO-1基因 mRNA表达量的变化情况。结果表明，52 ku酶解肽处理仔猪空肠上皮细胞后，MTT值和TEER呈时间-剂量依赖性降低（P<0.05）。24 h处理后，AP活性呈显著升高趋势（P<0.05）。与对照组相比，52 ku酶解肽可使Occludin和ZO-1 基因mRNA相对表达量均呈显著下降趋势（P<0.05）。总之，52 ku酶解肽使仔猪空肠上皮细胞通透性增加，并降低Occludin 或ZO-1的 mRNA表达。

本研究旨在构建可胞外分泌内切葡聚糖酶，且具有降解β-葡聚糖能力的转内切葡聚糖酶基因罗伊乳酸杆菌，并对其进行肉鸡饲喂效果验证，为后续转基因乳酸杆菌在动物生产中的应用奠定基础。采用PCR和酶切连接方法构建pLEM4157（cel） 载体，转化Lactobacillus.reuteri XC1感受态细胞，进行聚丙烯胺凝胶电泳表达谱分析和内切葡聚糖酶活性测定，同时测定其肉鸡饲喂效果。结果表明，克隆的内切葡聚糖酶基因大小为1 500 bp，经测序比对，与已报道基因序列相似性为99%，氨基酸序列相似性为100%；Native-PAGE 和SDS-PAGE分析结果表明，内切葡聚糖酶基因celW成熟肽在罗伊乳酸杆菌的蛋白分子量均为52 ku左右，与理论计算值相符； L.reuteri pLEM4157（cel） 培养上清和胞内上清内切葡聚糖酶活性分别为（0.96±0.08）和（0.37±0.09） U•mL^-1； L.reuteri pLEM4157（cel） 对肉仔鸡生长性能无显著影响，但可显著降低21日龄肉仔鸡十二指肠、空肠pH，促进21日龄肉仔鸡肾、法氏囊、胸腺和胰腺的生长发育，增加42 日龄肉仔鸡的胸腺和胰腺指数，提高肉仔鸡21日龄血清白球比、钙、磷含量和42 日龄血清葡萄糖含量。L.reuteri pLEM4157（cel） 成功分泌表达了内切葡聚糖酶，具有降解羧甲基纤维素的能力和一定的肉鸡饲喂效果。

本研究旨在构建可胞外分泌内切葡聚糖酶，且具有降解β-葡聚糖能力的转内切葡聚糖酶基因罗伊乳酸杆菌，并对其进行肉鸡饲喂效果验证，为后续转基因乳酸杆菌在动物生产中的应用奠定基础。采用PCR和酶切连接方法构建pLEM4157（cel） 载体，转化Lactobacillus.reuteri XC1感受态细胞，进行聚丙烯胺凝胶电泳表达谱分析和内切葡聚糖酶活性测定，同时测定其肉鸡饲喂效果。结果表明，克隆的内切葡聚糖酶基因大小为1 500 bp，经测序比对，与已报道基因序列相似性为99%，氨基酸序列相似性为100%；Native-PAGE 和SDS-PAGE分析结果表明，内切葡聚糖酶基因celW成熟肽在罗伊乳酸杆菌的蛋白分子量均为52 ku左右，与理论计算值相符； L.reuteri pLEM4157（cel） 培养上清和胞内上清内切葡聚糖酶活性分别为（0.96±0.08）和（0.37±0.09） U•mL^-1； L.reuteri pLEM4157（cel） 对肉仔鸡生长性能无显著影响，但可显著降低21日龄肉仔鸡十二指肠、空肠pH，促进21日龄肉仔鸡肾、法氏囊、胸腺和胰腺的生长发育，增加42 日龄肉仔鸡的胸腺和胰腺指数，提高肉仔鸡21日龄血清白球比、钙、磷含量和42 日龄血清葡萄糖含量。L.reuteri pLEM4157（cel） 成功分泌表达了内切葡聚糖酶，具有降解羧甲基纤维素的能力和一定的肉鸡饲喂效果。

本试验旨在评价不同添加剂对窖贮紫花苜蓿青贮发酵品质和有氧稳定性的影响。以初花期紫花苜蓿（Medicago sativa L.）为材料，田间凋萎至干物质含量50%左右时进行青贮。4个处理组：1）CK：对照组（不加添加剂），2）LAB：添加2×10⁵ cfu•g^-1乳酸菌组，3）LAB+M：添加2×10⁵ cfu•g^-1乳酸菌+2%糖蜜组，4）SD：添加0.1%脱氢乙酸钠组。青贮90 d启窖取样分析青贮饲料发酵指标和化学成分，同时进行有氧稳定性测试。结果表明：所有处理组青贮饲料发酵品质均良好。添加LAB、LAB+M和SD可显著提高苜蓿青贮的乳酸含量、乳酸/乙酸和干物质回收率（P＜0.05），显著降低氨态氮/总氮（P＜0.05），对粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和可溶性碳水化合物含量无显著影响（P＞0.05）；SD处理在pH、乳酸及氨态氮/总氮指标上的青贮效果要低于LAB和LAB+M处理，LAB和LAB+M处理的青贮效果相当。启窖后，LAB、LAB+M和SD处理的苜蓿青贮饲料有氧稳定性显著高于对照组（P＜0.05），且添加LAB的效果优于LAB+M和SD。综上表明，在紫花苜蓿窖贮条件下添加LAB可获得品质最优的青贮饲料。

本试验旨在评价不同添加剂对窖贮紫花苜蓿青贮发酵品质和有氧稳定性的影响。以初花期紫花苜蓿（Medicago sativa L.）为材料，田间凋萎至干物质含量50%左右时进行青贮。4个处理组：1）CK：对照组（不加添加剂），2）LAB：添加2×10⁵ cfu•g^-1乳酸菌组，3）LAB+M：添加2×10⁵ cfu•g^-1乳酸菌+2%糖蜜组，4）SD：添加0.1%脱氢乙酸钠组。青贮90 d启窖取样分析青贮饲料发酵指标和化学成分，同时进行有氧稳定性测试。结果表明：所有处理组青贮饲料发酵品质均良好。添加LAB、LAB+M和SD可显著提高苜蓿青贮的乳酸含量、乳酸/乙酸和干物质回收率（P＜0.05），显著降低氨态氮/总氮（P＜0.05），对粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和可溶性碳水化合物含量无显著影响（P＞0.05）；SD处理在pH、乳酸及氨态氮/总氮指标上的青贮效果要低于LAB和LAB+M处理，LAB和LAB+M处理的青贮效果相当。启窖后，LAB、LAB+M和SD处理的苜蓿青贮饲料有氧稳定性显著高于对照组（P＜0.05），且添加LAB的效果优于LAB+M和SD。综上表明，在紫花苜蓿窖贮条件下添加LAB可获得品质最优的青贮饲料。

对已经适应Vero细胞生长的猪流行性腹泻病毒CHYJ130330亲本代、第38代、第60代、第80代和第100代病毒的S、M、N基因分别进行测序及序列比对分析，结果显示M和N基因具有高度的保守性，多次传代后未发生氨基酸的改变；S基因在第38代时未发生任何突变，第100代时发生了17个核苷酸的点突变，导致15个氨基酸发生改变。动物试验显示，第60代病毒仍能引起仔猪呕吐、腹泻等症状，而第100代的病毒毒力已经减弱。S基因的突变是否与病毒的毒力减弱有关还需进一步试验验证。

对已经适应Vero细胞生长的猪流行性腹泻病毒CHYJ130330亲本代、第38代、第60代、第80代和第100代病毒的S、M、N基因分别进行测序及序列比对分析，结果显示M和N基因具有高度的保守性，多次传代后未发生氨基酸的改变；S基因在第38代时未发生任何突变，第100代时发生了17个核苷酸的点突变，导致15个氨基酸发生改变。动物试验显示，第60代病毒仍能引起仔猪呕吐、腹泻等症状，而第100代的病毒毒力已经减弱。S基因的突变是否与病毒的毒力减弱有关还需进一步试验验证。

为制备抗绵羊肺腺瘤病毒（JSRV）囊膜蛋白（ENV）胞质尾区（CT）的单克隆抗体，利用生物信息学分析JSRV囊膜蛋白氨基酸序列，根据分析结果合成多肽，将此多肽分别连接钥孔血蓝蛋白（CT-KLH）和牛血清白蛋白（CT-BSA），用CT-KLH作为抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。建立间接ELISA方法筛选分泌抗CT蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，获得1株能稳定分泌抗CT蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为8E5，亚类为 IgG2a/κ。间接ELISA检测培养上清效价为6.4×10³，腹水效价为1×10⁵。Western blot及免疫组化结果显示，这株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能识别JSRV抗原，与其发生特异性反应。试验结果证明，单抗8E5是绵羊肺腺瘤的重要诊断试剂。应用8E5细胞株分泌的单克隆抗体建立JSRV-ENV的双抗体夹心ELISA检测方法，该ELISA检测方法特异性、重复性和敏感性良好，为快速检测诊断绵羊肺腺瘤和研究囊膜蛋白功能奠定了基础。

为制备抗绵羊肺腺瘤病毒（JSRV）囊膜蛋白（ENV）胞质尾区（CT）的单克隆抗体，利用生物信息学分析JSRV囊膜蛋白氨基酸序列，根据分析结果合成多肽，将此多肽分别连接钥孔血蓝蛋白（CT-KLH）和牛血清白蛋白（CT-BSA），用CT-KLH作为抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。建立间接ELISA方法筛选分泌抗CT蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，获得1株能稳定分泌抗CT蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为8E5，亚类为 IgG2a/κ。间接ELISA检测培养上清效价为6.4×10³，腹水效价为1×10⁵。Western blot及免疫组化结果显示，这株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能识别JSRV抗原，与其发生特异性反应。试验结果证明，单抗8E5是绵羊肺腺瘤的重要诊断试剂。应用8E5细胞株分泌的单克隆抗体建立JSRV-ENV的双抗体夹心ELISA检测方法，该ELISA检测方法特异性、重复性和敏感性良好，为快速检测诊断绵羊肺腺瘤和研究囊膜蛋白功能奠定了基础。

应用差异蛋白质组学研究感染新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）番鸭后的肝和正常番鸭肝的蛋白质组差异，为深入研究NDRV的致病机制奠定良好理论基础。通过二维双向凝胶电泳技术和MALDI-TOF-TOF质谱仪分析获取NDRV感染组与非感染对照组之间的差异表达蛋白质，并运用蛋白质搜索鉴定软件Mascot 2.3.02鉴定蛋白质。结果共鉴定出26个差异表达蛋白质。感染组和非感染对照组比较，感染组肝中有9个表达下调的蛋白质和12个表达上调的蛋白质，3个表达蛋白质仅出现在非感染组，2个表达蛋白质仅出现在感染组。NDRV感染组的番鸭肝有肝细胞受损现象。差异蛋白质组学为NDRV分子发病机制的分析提供了一个新途径。

应用差异蛋白质组学研究感染新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）番鸭后的肝和正常番鸭肝的蛋白质组差异，为深入研究NDRV的致病机制奠定良好理论基础。通过二维双向凝胶电泳技术和MALDI-TOF-TOF质谱仪分析获取NDRV感染组与非感染对照组之间的差异表达蛋白质，并运用蛋白质搜索鉴定软件Mascot 2.3.02鉴定蛋白质。结果共鉴定出26个差异表达蛋白质。感染组和非感染对照组比较，感染组肝中有9个表达下调的蛋白质和12个表达上调的蛋白质，3个表达蛋白质仅出现在非感染组，2个表达蛋白质仅出现在感染组。NDRV感染组的番鸭肝有肝细胞受损现象。差异蛋白质组学为NDRV分子发病机制的分析提供了一个新途径。

为进一步了解鸡传染性支气管炎病毒（IBV）流行株的遗传变异情况，对2013年从免疫失败的广西某鸡场中分离到的一株IBV（GX-NN130048）进行S1、E、M和N基因的扩增、测序、相似性比较、系统进化树绘制和重组分析以及血清型鉴定。基因序列分析结果表明，分离株GX-NN130048的S蛋白裂解位点序列为RRSRR，S1、E、M和N基因与参考株核苷酸相似性分别在60.8%~90.1%、81.0%~94.2%、86.1%~93.8%和86.0%~93.3%；进化树分析显示，分离株GX-NN130048的S1基因与疫苗毒株4/91同属一群，而E、M和N基因则与毒株LX4属于同一群；重组分析显示，分离株GX-NN130048的S1基因来源于疫苗毒株4/91和GX-HC1006野毒株（LX4型）的重组；血清型分析表明，该分离株的血清型不同于疫苗株H120和4/91。研究表明分离株GX-NN130048是一株重组毒株，其结构基因和血清型均发生变异。本研究再次提供证据说明，疫苗株4/91越来越多参与到IBV流行株通过基因重组导致的遗传变异事件当中，并可能由此导致新血清型的出现。这可能是现场免疫失败的一个主要原因。有必要继续加强对IBV的监测和新疫苗的研发。

为进一步了解鸡传染性支气管炎病毒（IBV）流行株的遗传变异情况，对2013年从免疫失败的广西某鸡场中分离到的一株IBV（GX-NN130048）进行S1、E、M和N基因的扩增、测序、相似性比较、系统进化树绘制和重组分析以及血清型鉴定。基因序列分析结果表明，分离株GX-NN130048的S蛋白裂解位点序列为RRSRR，S1、E、M和N基因与参考株核苷酸相似性分别在60.8%~90.1%、81.0%~94.2%、86.1%~93.8%和86.0%~93.3%；进化树分析显示，分离株GX-NN130048的S1基因与疫苗毒株4/91同属一群，而E、M和N基因则与毒株LX4属于同一群；重组分析显示，分离株GX-NN130048的S1基因来源于疫苗毒株4/91和GX-HC1006野毒株（LX4型）的重组；血清型分析表明，该分离株的血清型不同于疫苗株H120和4/91。研究表明分离株GX-NN130048是一株重组毒株，其结构基因和血清型均发生变异。本研究再次提供证据说明，疫苗株4/91越来越多参与到IBV流行株通过基因重组导致的遗传变异事件当中，并可能由此导致新血清型的出现。这可能是现场免疫失败的一个主要原因。有必要继续加强对IBV的监测和新疫苗的研发。

为评价分子佐剂细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)对IBDV VP2质粒DNA的免疫增强作用，试验采用重组质粒载体表达重组蛋白mLTA-VP2-CTLA-4和mLTA-CTLA-4，家兔毒性试验确定其安全性，后选择10日龄非免疫健康鸡进行随机分组试验，设不同剂量mLTA-CTLA-4加IBD活疫苗免疫组、不同剂量mLTA-VP2-CTLA-4免疫组、IBD活疫苗免疫组及空白对照组，免疫后用ELISA法定期检测鸡血清抗体IgG及小肠黏膜抗体IgA效价；鸡在加强免疫后用IBDV野生毒株攻击，连续观察2周并计算保护率。结果显示，mLTA-VP2-CTLA-4免疫组、mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平与活疫苗免疫组无明显差别，mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平略高于mLTA-VP2-CTLA-4免疫组，疫苗对鸡的保护率为100%。结果表明，构建的IBDV分子佐剂DNA疫苗载体能表达无毒性的重组蛋白质，并能产生很好的免疫保护率，为进一步研究IBD亚单位疫苗奠定基础。

为评价分子佐剂细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)对IBDV VP2质粒DNA的免疫增强作用，试验采用重组质粒载体表达重组蛋白mLTA-VP2-CTLA-4和mLTA-CTLA-4，家兔毒性试验确定其安全性，后选择10日龄非免疫健康鸡进行随机分组试验，设不同剂量mLTA-CTLA-4加IBD活疫苗免疫组、不同剂量mLTA-VP2-CTLA-4免疫组、IBD活疫苗免疫组及空白对照组，免疫后用ELISA法定期检测鸡血清抗体IgG及小肠黏膜抗体IgA效价；鸡在加强免疫后用IBDV野生毒株攻击，连续观察2周并计算保护率。结果显示，mLTA-VP2-CTLA-4免疫组、mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平与活疫苗免疫组无明显差别，mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平略高于mLTA-VP2-CTLA-4免疫组，疫苗对鸡的保护率为100%。结果表明，构建的IBDV分子佐剂DNA疫苗载体能表达无毒性的重组蛋白质，并能产生很好的免疫保护率，为进一步研究IBD亚单位疫苗奠定基础。

为研究鸡MDA5（chMDA5）及其信号通路因子在传染性法氏囊病病毒（IBDV）感染雏鸡体内的表达情况，将40只14日龄SPF雏鸡随机分为感染组和对照组，感染组雏鸡经点眼、滴鼻方式给予IBDV液，对照组雏鸡于相同日龄、相同途径给予相同剂量PBS，于感染后第1、4、7及21天采取雏鸡外周血液并分离淋巴细胞，采用实时荧光定量PCR方法检测雏鸡外周血液淋巴细胞chMDA5信号通路因子mRNA转录及IBDV载量的动态变化。结果表明，IBDV感染雏鸡后第4天病毒载量较感染后第1天明显升高，之后逐渐下降；雏鸡淋巴细胞chMDA5及其信号通路因子表达量在感染后第4天均有明显的上升（P<0.01或P<0.05），感染后第7—21天又出现下调。IBDV能够激活雏鸡体内chMDA5信号通路，并且IBDV复制与chMDA5信号通路因子的表达有着密切关系。

为研究鸡MDA5（chMDA5）及其信号通路因子在传染性法氏囊病病毒（IBDV）感染雏鸡体内的表达情况，将40只14日龄SPF雏鸡随机分为感染组和对照组，感染组雏鸡经点眼、滴鼻方式给予IBDV液，对照组雏鸡于相同日龄、相同途径给予相同剂量PBS，于感染后第1、4、7及21天采取雏鸡外周血液并分离淋巴细胞，采用实时荧光定量PCR方法检测雏鸡外周血液淋巴细胞chMDA5信号通路因子mRNA转录及IBDV载量的动态变化。结果表明，IBDV感染雏鸡后第4天病毒载量较感染后第1天明显升高，之后逐渐下降；雏鸡淋巴细胞chMDA5及其信号通路因子表达量在感染后第4天均有明显的上升（P<0.01或P<0.05），感染后第7—21天又出现下调。IBDV能够激活雏鸡体内chMDA5信号通路，并且IBDV复制与chMDA5信号通路因子的表达有着密切关系。

为了研究马立克病（MD）火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗接种和抗性选育对鸡马立克病毒（MDV-1）攻毒后羽囊中病毒载量的影响，选择普通霞烟鸡及其MD抗性品系，利用MDV-1攻毒后第7、14、21、28和35 天（DPI）五次采集并分离的全部试验鸡的羽囊为材料，采用Real-time FQ-PCR技术对这些材料中meq基因进行绝对定量分析以确定其病毒载量，用来分析比较MDV-1在MD抗性/普通鸡及HVT疫苗免疫/HVT疫苗未免疫鸡体内的增殖情况。结果显示：1）从MD抗性对病毒载量的影响看，一方面，普通非免疫攻毒组（F组）的MDV-1含量于14、21DPI时显著（P<0.05）高于MD抗性非免疫攻毒组（T组）；另一方面，MD抗性免疫攻毒组（R组）的MDV-1含量总体上却和普通免疫攻毒组（G组）相当。2）从HVT疫苗免疫对病毒载量的影响看，一方面，MD抗性非免疫攻毒组（T组）的MDV-1含量于28 DPI时显著（P<0.05）高于MD抗性免疫攻毒组（R组）；另一方面，普通非免疫攻毒组（F组） 的MDV-1含量于14、21 DPI时显著（P<0.05）高于普通免疫攻毒组（G组）。3）从MD抗性协同HVT疫苗免疫对病毒载量的影响看，普通非免疫攻毒组（F组）的MDV-1含量于14（P<0.05）、28（P<0.01）、35（P<0.05）DPI时显著高于MD抗性免疫攻毒组（R组）。结果表明，鸡MD抗性选育协同HVT疫苗接种可显著降低鸡羽囊的病毒载量，这将会降低MDV-1传播风险，并提高鸡的存活机会。

为了研究马立克病（MD）火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗接种和抗性选育对鸡马立克病毒（MDV-1）攻毒后羽囊中病毒载量的影响，选择普通霞烟鸡及其MD抗性品系，利用MDV-1攻毒后第7、14、21、28和35 天（DPI）五次采集并分离的全部试验鸡的羽囊为材料，采用Real-time FQ-PCR技术对这些材料中meq基因进行绝对定量分析以确定其病毒载量，用来分析比较MDV-1在MD抗性/普通鸡及HVT疫苗免疫/HVT疫苗未免疫鸡体内的增殖情况。结果显示：1）从MD抗性对病毒载量的影响看，一方面，普通非免疫攻毒组（F组）的MDV-1含量于14、21DPI时显著（P<0.05）高于MD抗性非免疫攻毒组（T组）；另一方面，MD抗性免疫攻毒组（R组）的MDV-1含量总体上却和普通免疫攻毒组（G组）相当。2）从HVT疫苗免疫对病毒载量的影响看，一方面，MD抗性非免疫攻毒组（T组）的MDV-1含量于28 DPI时显著（P<0.05）高于MD抗性免疫攻毒组（R组）；另一方面，普通非免疫攻毒组（F组） 的MDV-1含量于14、21 DPI时显著（P<0.05）高于普通免疫攻毒组（G组）。3）从MD抗性协同HVT疫苗免疫对病毒载量的影响看，普通非免疫攻毒组（F组）的MDV-1含量于14（P<0.05）、28（P<0.01）、35（P<0.05）DPI时显著高于MD抗性免疫攻毒组（R组）。结果表明，鸡MD抗性选育协同HVT疫苗接种可显著降低鸡羽囊的病毒载量，这将会降低MDV-1传播风险，并提高鸡的存活机会。

拟检测BAT3蛋白过表达对由PrP106-126毒性多肽引起的神经元凋亡现象的影响。首先通过免疫荧光、CCK8细胞活性检测试剂盒和免疫印迹检测带FITC标签的PrP106-126-FITC毒性多肽的生物学毒性。分别用PrP106-126-FITC和PrP106-126神经毒性多肽处理原代神经元和Neuro2a细胞，通过免疫荧光技术和免疫印迹方法分别检测受刺激后的原代神经元和Neuro2a细胞中BAT3表达的变化情况。通过脂质体转染方法将已经构建好的pcDNA-3.1-HA-BAT3质粒转染进入原代神经元，用CCK8检测细胞活性；以同样方式将质粒转染进入小鼠神经瘤细胞系Neuro2a，用TUNEL凋亡检测试剂盒分析经BAT3转染或对照组的N2a细胞的凋亡水平；Western blot检测PrP106-126神经毒性多肽处理前后，胞质内细胞色素C和Bcl-2的变化，进一步了解BAT3在神经元凋亡中发挥作用的机制。结果显示，PrP106-126-FITC和PrP106-126神经毒性多肽具有相似的神经毒性。受到多肽刺激之后，无论在原代神经元还是传代细胞系Neuro2a中，BAT3都发生核输出现象，BAT3从细胞核转移进入细胞质。BAT3的过表达使受到PrP106-126毒性多肽刺激的神经元的细胞活性有所提高，Neuro2a的细胞凋亡现象减轻，同时抑制了由PrP106-126毒性多肽引起的细胞色素C的过度释放并且维持细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的稳定。BAT3蛋白的表达缓解PrP106-126毒性多肽对神经细胞造成的凋亡现象，为进一步阐释该蛋白质对朊病毒引起的神经元损失的治疗作用机制提供了依据。

拟检测BAT3蛋白过表达对由PrP106-126毒性多肽引起的神经元凋亡现象的影响。首先通过免疫荧光、CCK8细胞活性检测试剂盒和免疫印迹检测带FITC标签的PrP106-126-FITC毒性多肽的生物学毒性。分别用PrP106-126-FITC和PrP106-126神经毒性多肽处理原代神经元和Neuro2a细胞，通过免疫荧光技术和免疫印迹方法分别检测受刺激后的原代神经元和Neuro2a细胞中BAT3表达的变化情况。通过脂质体转染方法将已经构建好的pcDNA-3.1-HA-BAT3质粒转染进入原代神经元，用CCK8检测细胞活性；以同样方式将质粒转染进入小鼠神经瘤细胞系Neuro2a，用TUNEL凋亡检测试剂盒分析经BAT3转染或对照组的N2a细胞的凋亡水平；Western blot检测PrP106-126神经毒性多肽处理前后，胞质内细胞色素C和Bcl-2的变化，进一步了解BAT3在神经元凋亡中发挥作用的机制。结果显示，PrP106-126-FITC和PrP106-126神经毒性多肽具有相似的神经毒性。受到多肽刺激之后，无论在原代神经元还是传代细胞系Neuro2a中，BAT3都发生核输出现象，BAT3从细胞核转移进入细胞质。BAT3的过表达使受到PrP106-126毒性多肽刺激的神经元的细胞活性有所提高，Neuro2a的细胞凋亡现象减轻，同时抑制了由PrP106-126毒性多肽引起的细胞色素C的过度释放并且维持细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的稳定。BAT3蛋白的表达缓解PrP106-126毒性多肽对神经细胞造成的凋亡现象，为进一步阐释该蛋白质对朊病毒引起的神经元损失的治疗作用机制提供了依据。

拟研究滴鼻给予猪鼻枯草芽孢杆菌芽孢对咽鼓管扁桃体和软腭扁桃体内树突状细胞数量的影响。10头2月龄杜长大三元杂交仔猪随机分为2组，分别用枯草芽孢杆菌芽孢和PBS进行鼻腔滴鼻，3 h后打开鼻腔取出咽鼓管扁桃体和软腭扁桃体。选用MHCII、CD11b和CD16三种猪树突状细胞（DCs）抗体，对咽鼓管扁桃体和软腭扁桃体内DCs进行标记，通过共聚焦显微镜观察滴鼻前后DCs的变化情况。结果表明：应用枯草芽孢杆菌芽孢滴鼻后，咽鼓管扁桃体固有层和淋巴小结内CD11b^＋CD16^＋DCs和CD11b^＋MHCII^＋DCs的数量显著增加（P＜0.05），是正常对照的2~3倍；软腭扁桃体固有层和淋巴小结内CD11b^＋CD16^＋DCs和CD11b^＋MHCII^＋DCs的数量也显著增加（P＜0.05）；并且CD11b^＋MHCII^＋DCs数量比CD11b^＋CD16^＋DCs多，但差异不显著。笔者的研究提示枯草芽孢杆菌芽孢滴鼻能够诱导树突状细胞在扁桃体内聚集，并促进树突状细胞成熟，从而有效提高扁桃体抵抗病原微生物入侵的能力。

拟研究滴鼻给予猪鼻枯草芽孢杆菌芽孢对咽鼓管扁桃体和软腭扁桃体内树突状细胞数量的影响。10头2月龄杜长大三元杂交仔猪随机分为2组，分别用枯草芽孢杆菌芽孢和PBS进行鼻腔滴鼻，3 h后打开鼻腔取出咽鼓管扁桃体和软腭扁桃体。选用MHCII、CD11b和CD16三种猪树突状细胞（DCs）抗体，对咽鼓管扁桃体和软腭扁桃体内DCs进行标记，通过共聚焦显微镜观察滴鼻前后DCs的变化情况。结果表明：应用枯草芽孢杆菌芽孢滴鼻后，咽鼓管扁桃体固有层和淋巴小结内CD11b^＋CD16^＋DCs和CD11b^＋MHCII^＋DCs的数量显著增加（P＜0.05），是正常对照的2~3倍；软腭扁桃体固有层和淋巴小结内CD11b^＋CD16^＋DCs和CD11b^＋MHCII^＋DCs的数量也显著增加（P＜0.05）；并且CD11b^＋MHCII^＋DCs数量比CD11b^＋CD16^＋DCs多，但差异不显著。笔者的研究提示枯草芽孢杆菌芽孢滴鼻能够诱导树突状细胞在扁桃体内聚集，并促进树突状细胞成熟，从而有效提高扁桃体抵抗病原微生物入侵的能力。

探讨高原老龄牦牛睾丸组织结构特点与其生殖机能的关系。采集9~13岁健康老龄牦牛睾丸组织，应用组织化学染色和透射电镜技术，观察其细胞化学特点及结构特征。结果显示，老龄牦牛睾丸体积及重量左侧略大于右侧，光镜下睾丸被膜、间质组织胶原纤维及网状纤维丰富，小叶不明显，Leydig 细胞散在于结缔组织之间，生精小管不同程度退化，生精上皮层数为2~5层，细胞间隙变大，部分脱落，Sertoli 细胞低矮，细胞质较少。电镜观察Sertoli 细胞核外形不规则，内质网呈疏松的泡状，次级溶酶体增加，体积增大。相邻Sertoli 细胞间没有观察到并行的内质网层和细丝束这一血-睾屏障所特有外质特化区形态结构，部分生精小管固有膜胶原纤维增生，上皮皱缩；Leydig 细胞内脂滴异常丰富，毛细血管内皮细胞间存在紧密连接。间质组织偶有肥大细胞，间质血管及生精小管固有膜中PAS及AB-PAS阳性反应明显。老龄牦牛Sertoli 细胞细胞器结构异常，血-睾屏障中Sertoli 细胞间的连接处缺陷，且Sertoli 细胞与基膜连接的改变可能影响了Sertoli 细胞和生精细胞之间的相互作用，进而抑制了生精细胞的功能。

探讨高原老龄牦牛睾丸组织结构特点与其生殖机能的关系。采集9~13岁健康老龄牦牛睾丸组织，应用组织化学染色和透射电镜技术，观察其细胞化学特点及结构特征。结果显示，老龄牦牛睾丸体积及重量左侧略大于右侧，光镜下睾丸被膜、间质组织胶原纤维及网状纤维丰富，小叶不明显，Leydig 细胞散在于结缔组织之间，生精小管不同程度退化，生精上皮层数为2~5层，细胞间隙变大，部分脱落，Sertoli 细胞低矮，细胞质较少。电镜观察Sertoli 细胞核外形不规则，内质网呈疏松的泡状，次级溶酶体增加，体积增大。相邻Sertoli 细胞间没有观察到并行的内质网层和细丝束这一血-睾屏障所特有外质特化区形态结构，部分生精小管固有膜胶原纤维增生，上皮皱缩；Leydig 细胞内脂滴异常丰富，毛细血管内皮细胞间存在紧密连接。间质组织偶有肥大细胞，间质血管及生精小管固有膜中PAS及AB-PAS阳性反应明显。老龄牦牛Sertoli 细胞细胞器结构异常，血-睾屏障中Sertoli 细胞间的连接处缺陷，且Sertoli 细胞与基膜连接的改变可能影响了Sertoli 细胞和生精细胞之间的相互作用，进而抑制了生精细胞的功能。

本试验旨在研究发酵中药制剂对肉仔鸡免疫机能和抗氧化机能的影响。发酵中药是将中药粉剂（组方为黄芪、贯众、板蓝根、何首乌、山楂、女贞子、艾叶）按比例加入六神曲、淀粉、水混匀，在30 ℃的生化培养箱中发酵48 h制得。为了检测该制剂的使用效果，特做以下试验：180只1日龄雄性AA肉仔鸡随机分为3个处理，每个处理6个重复，每个重复10只鸡，分别饲喂日粮：A组，饲喂基础日粮；B组，饲喂基础日粮+0.5%中药；C组，饲喂基础日粮+0.5%发酵中药。试验结果表明：（1）与空白对照组相比，发酵中药显著提高了3周龄仔鸡胸腺指数（P<0.05）、血清溶菌酶的活性（P<0.05）、6周龄仔鸡血浆谷胱甘肽过氧化物酶的活性（P<0.05），显著降低了6周龄仔鸡腿肌MDA含量（P<0.05）；（2）与中药对照组相比，发酵中药显著提高了3周龄仔鸡胸腺指数（P<0.05）、ND抗体水平（P<0.05）。结果表明，发酵中药显著改善肉仔鸡的免疫机能和抗氧化机能，其使用效果优于中药组。

本试验旨在研究发酵中药制剂对肉仔鸡免疫机能和抗氧化机能的影响。发酵中药是将中药粉剂（组方为黄芪、贯众、板蓝根、何首乌、山楂、女贞子、艾叶）按比例加入六神曲、淀粉、水混匀，在30 ℃的生化培养箱中发酵48 h制得。为了检测该制剂的使用效果，特做以下试验：180只1日龄雄性AA肉仔鸡随机分为3个处理，每个处理6个重复，每个重复10只鸡，分别饲喂日粮：A组，饲喂基础日粮；B组，饲喂基础日粮+0.5%中药；C组，饲喂基础日粮+0.5%发酵中药。试验结果表明：（1）与空白对照组相比，发酵中药显著提高了3周龄仔鸡胸腺指数（P<0.05）、血清溶菌酶的活性（P<0.05）、6周龄仔鸡血浆谷胱甘肽过氧化物酶的活性（P<0.05），显著降低了6周龄仔鸡腿肌MDA含量（P<0.05）；（2）与中药对照组相比，发酵中药显著提高了3周龄仔鸡胸腺指数（P<0.05）、ND抗体水平（P<0.05）。结果表明，发酵中药显著改善肉仔鸡的免疫机能和抗氧化机能，其使用效果优于中药组。

DncV（VC0179）是在霍乱弧菌中发现的一种双核苷酸环化酶，其可以合成c-di-AMP、c-di-GMP和c-GAMP。研究发现c-di-GMP作为胞内的第二信使，通过STING信号通路激活先天性免疫应答。为了体外制备c-di-GMP用于深入研究其功能，构建了VC0179融合cherry标签的丙酸诱导型表达载体，并将该重组表达载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）中。利用丙酸钠诱导表达后，观察菌体颜色是否为红色判断融合蛋白质的表达。超声破碎细菌后经SDS-PAGE电泳检测融合蛋白质的可溶性表达。最后通过Ni-NTA Agarose亲和纯化重组蛋白质，获得的重组蛋白质进行体外酶促反应，高效液相色谱检测合成产物c-di-GMP。结果表明：成功构建VC0179丙酸诱导型原核表达载体并获得了高纯度的VC0179重组蛋白质。该重组蛋白质通过体外酶促反应可一步生成c-di-GMP。本试验建立了稳定获得具有酶活性的VC0179重组蛋白质的方法；c-di-GMP的体外合成为其后续功能研究及大量制备奠定基础。

DncV（VC0179）是在霍乱弧菌中发现的一种双核苷酸环化酶，其可以合成c-di-AMP、c-di-GMP和c-GAMP。研究发现c-di-GMP作为胞内的第二信使，通过STING信号通路激活先天性免疫应答。为了体外制备c-di-GMP用于深入研究其功能，构建了VC0179融合cherry标签的丙酸诱导型表达载体，并将该重组表达载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）中。利用丙酸钠诱导表达后，观察菌体颜色是否为红色判断融合蛋白质的表达。超声破碎细菌后经SDS-PAGE电泳检测融合蛋白质的可溶性表达。最后通过Ni-NTA Agarose亲和纯化重组蛋白质，获得的重组蛋白质进行体外酶促反应，高效液相色谱检测合成产物c-di-GMP。结果表明：成功构建VC0179丙酸诱导型原核表达载体并获得了高纯度的VC0179重组蛋白质。该重组蛋白质通过体外酶促反应可一步生成c-di-GMP。本试验建立了稳定获得具有酶活性的VC0179重组蛋白质的方法；c-di-GMP的体外合成为其后续功能研究及大量制备奠定基础。