施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法的建立

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.022

畜牧兽医学报 ›› 2015, Vol. 46 ›› Issue (1): 174-178.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.022

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施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法的建立

张永强，吴晓东，赵永刚，王志亮^*

（中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032）

收稿日期:2014-05-26 出版日期:2015-01-23 发布日期:2015-02-02
通讯作者: 王志亮（1966-），研究员，博士生导师，E-mail：zlwang111@163.com
作者简介:张永强（1977- ），男，山东邹平人，博士，助理研究员，主要从事病毒分子生物学研究，Tel：0532-87839922，E-mail:zhangyq_l@163.com
基金资助:
现代农业产业技术体系（奶牛）（NYCYTX-0305）

Establishment of Detection and Identification Method for Schmallenberg Virus by Pyrosequencing

ZHANG Yong-qiang，WU Xiao-dong，ZHAO Yong-gang，WANG Zhi-liang^*

（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032,China）

Received:2014-05-26 Online:2015-01-23 Published:2015-02-02

摘要/Abstract

摘要：

拟建立施马伦贝格病毒（SBV）S基因焦磷酸测序检测方法，用于施马伦贝格病毒病的快速检测和确诊。通过对公开发表的SBV S基因序列与布尼病毒科其他11种病毒S基因进行比对，找出不同病毒变异区域集中且变异区域两侧保守的序列片段，基因合成，体外转录，作为基因扩增模板。在特异性变异序列两端的保守区域设计扩增引物，进行RT-PCR扩增。在保守区域设计双向测序引物，对RT-PCR产物进行双向焦磷酸测序。通过比对测序结果，确定是否为SBV核酸序列；优化条件，确定检测方法的敏感性、特异性和重复性，建立SBV S基因焦磷酸测序检测方法。结果：建立的施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法扩增基因片段长度为166 bp；敏感性为可检测到104个拷贝；每一条测序引物可准确测出50 bp左右核酸序列，双向测序可准确测出100 bp左右核酸序列，具有较好特异性，完全满足施马伦贝格病毒病确诊要求；重复测序3次，均能准确测出100 bp左右核酸序列。本研究建立的施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法，可用于施马伦贝格病毒病的检测和确诊，整个检测过程可在1 d内完成，大大缩短了确诊时间。

关键词: 焦磷酸测序, 施马伦贝格病毒, S基因

Abstract:

The aim of the present study was to establish a pyrosequencing method targeting S gene for detection and identification of schmallenberg virus (SBV).In alignment with published more than 10 viruses S gene sequences which belong to Bunyaviridae and are highly homogenous with SBV.Adaptive sequence for pyrosequencing was synthesized and in vitro transcripted to cRNA as the RT-PCR templates.After RT-PCR reaction，the products were detected with forward and reverse pyrosequencing and identified by genomic alignment.Results showed that the RT-PCR products were 166 bp.The sensitivity of the method that the minimum copies could be detected was 104 copies.The specificity that sequencing length by pyrosequencing was around 100 bp which could make a definite diagnosis for SBV.The results presented here demonstrate that the detection and identification method for SBV by pyrosequencing was established.The method can be used in fast diagnosis for SBV.

Key words: pyrosequencing, schmallenberg virus, S gene

中图分类号:

S852.659.5

张永强，吴晓东，赵永刚，王志亮. 施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(1): 174-178.

ZHANG Yong-qiang，WU Xiao-dong，ZHAO Yong-gang，WANG Zhi-liang. Establishment of Detection and Identification Method for Schmallenberg Virus by Pyrosequencing[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2015, 46(1): 174-178.

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