不同因素对疯草内生真菌合成苦马豆素的影响

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.021

摘要/Abstract

摘要：

研究不同因素对疯草内生真菌——Undifilum oxytropis合成苦马豆素的影响，筛选出显著影响U.oxytropis苦马豆素合成的因素。将U.oxytropis分别接种到不同pH或不同浓度聚乙二醇（PEG）、L-哌可酸、L-赖氨酸、α-酮戊二酸的培养基中培养，测定菌丝及其发酵液中苦马豆素，分析各条件下真菌苦马豆素产率的变化。结果表明：当pH在4.5～6.5时，随pH增加，真菌SW产率显著增加（P<0.05）；当PEG质量浓度在0～32 g•L^－1时，随PEG增加，真菌苦马豆素产率显著降低（P<0.01）；当在培养基中添加相同量（10^-3 mol•L^－1）的L-哌可酸、L-赖氨酸、ɑ-酮戊二酸时，L-哌可酸添加组的苦马豆素产率显著降低（P<0.05），L-赖氨酸添加组苦马豆素产率显著增加（P<0.05）；当L-哌可酸的初始浓度为10^-3和10^-2 mol•L^－1时，真菌的苦马豆素产率显著下降（P<0.05），当其浓度为10^-4 mol•L^－1时，苦马豆素产率显著增加（P<0.01）；当L-赖氨酸的初始浓度为10^-1、10^-2或10^-4 mol•L^－1时，真菌苦马豆素产率显著降低（P<0.05）。当ɑ-酮戊二酸的初始浓度分别为10^-1、10^-2、10^-3 mol•L^－1时，真菌的苦马豆素产率显著降低（P<0.05）。由试验可知，低pH或添加PEG可抑制U.oxytropis中苦马豆素的合成，L-哌可酸、L-赖氨酸、α-酮戊二酸均对U.oxytropis的苦马豆素合成产生显著影响，但对苦马豆素合成的影响与各物质在培养基中的浓度密切相关。

关键词: 疯草, 内生真菌, 棘豆波状芽管蠕孢菌, 苦马豆素, 生物合成

Abstract:

The research was conducted to screen the influence factors on swainsonine production in fungal endophyte，Undifilum oxytropis，from locoweed.U.oxytropis were inoculated in liquid medium of different pH or containing different concentration of PEG，L-pipecolic acid，L-lysine and ɑ-ketoglutaric acid，respectively.To estimate the influence of different factors on swainsonine production in U.oxytropis，the swainsonine of cultured fungal mycelia and zymotic fluid were extracted and detected after shaking culture.The results showed that low pH (pH4.5) inhibit significantly (P<0.05) the synthesis of swainsonine in fungi.With the increase of PEG in culture medium，the production of swainsonine in fungi was also inhibited significantly (P<0.01).When the fungi were inoculated respectively in liquid medium that contained equivalent concentration (10^-3 mol•L^-1) of L-pipecolic acid，L-lysine or ɑ-ketoglutaric acid，the production of swainsonine was inhibited significantly (P<0.05) in the group added L-pipecolic acid.However，the yield of swainsonine were increased significantly(P<0.05) in the group added L-lysine.When the initial concentration of L-pipecolic acid was 10^-3 and 10^-2 mol•L^-1，the production of swainsonine in U.oxytropis was inhibited significantly (P<0.05).However，when the initial concentration of L-pipecolic acid was 10^-4 mol•L^-1，the yield of swainsonine in U.oxytropis was increased significantly (P<0.01).When the initial concentration of L-lysine was 10^-1，10^-2 and 10^-4 mol•L^-1，the production of swainsonine in U.oxytropis was inhibited significantly (P<0.05).When the initial concentration of ɑ-ketoglutaric acid was 10^-1，10^-2 and 10^-3 mol•L^-1，the production of swainsonine in U.oxytropis was inhibited significantly(P<0.05).Low pH or PEG added to medium could significantly inhibit the production of swainsonine in U.oxytropis.It was significant that the influence of L-pipecolic acid，L-lysine and ɑ-ketoglutaric acid on the swainsonine producing of fungal endophyte.However，the extent of influence on fungal swainsonine producing was highly correlated with the concentration of L-pipecolic acid，L-lysine and ɑ-ketoglutaric in liquid media.

Key words: locoweed, fungal endophyte, Undifilum oxytropis, swainsonine, biosynthesis

中图分类号:

S852.66

张蕾蕾，余永涛，何生虎，赵清梅，葛松. 不同因素对疯草内生真菌合成苦马豆素的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(1): 163-173.

ZHANG Lei-lei，YU Yong-tao，HE Sheng-hu，ZHAO Qing-mei，GE Song. Influence of Different Factors on Swainsonine Production in Fungal Endophyte from Locoweed[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2015, 46(1): 163-173.

参考文献

［1］史志诚.中国草地重要有毒植物［M］.北京：中国农业出版社，1997：12-66.
SHI Z C.Importent poisonous plants of china grassland［M］.Beijing：China Agriculture Press，1997:12-66.（in Chinese）
［2］赵宝玉，樊月圆，樊泽峰，等.我国西部草原疯草危害及其动物中毒病的控制［J］.草食家畜，2006（1）：12-15.
ZHAO B Y，FAN Y Y，FAN Z F，et al.The damage and control of locoweed and locosim in western grassland of China ［J］.Grass Feeding Livestock，2006（1）:12-15.（in Chinese）
［3］MOLYNEUX R J，JAMES L F.Loco intoxication：indolizidine alkaloids of spotted locoweed(Astragalus lentiginosus)［J］.Science，1982，216(4542)：190-191.
［4］王凯，曹光荣，段得贤，等.黄花棘豆对山羊的毒性研究［J］.畜牧兽医学报，1990，21(1) ：80-86.
WANG K，CAO G R，DUAN D X，et al.A study on toxicity of Oxytropis ochrochphala in goats［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，1990，21(1)：80-86.（in Chinese）
［5］李建科，杨具田，潘和平，等.家畜黄花棘豆、甘肃棘豆中毒的调查［J］.中国兽医科技，1987（5）：22-23.
LI J K，YANG J T，PAN H P，et al.A investigation on poisoning of Oxytropis ochrochphala and Oxytropis kansuensis in livestock ［J］.Veterinary Science in China，1987（5）：22-23.（in Chinese）
［6］赵宝玉，曹光荣，段得贤，等.西藏茎直黄芪对山羊的毒性研究［J］.畜牧兽医学报，1992，23(3)：276-280.
ZHAO B Y，CAO G R，DUAN D X，et al.A study on toxicity of Astragalus strictus in goats in Tibet［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，1992，23(3)：276-280.（in Chinese）
［7］余永涛，耿果霞，刘志滨,等.家畜毛瓣棘豆中毒研究［J］.草业科学，2006，23(5) ：75-77.
YU Y T，GENG G X，LIU Z B，et al.Progress in the study of Oxytropis serioopetala poisoning in domestic animals［J］.Pratacultural Science，2006，23(5)：75-77.（in Chinese）
［8］余永涛.毛瓣棘豆的毒性及其主要化学成分研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2006.
YU Y T.Studies on the toxicity and major chemical constitutients of Oxytropis serioopetala C.R.C.Fisch［D］.Yangling：Northwest A＆F University,2006.（in Chinese）
［9］高新磊，韩冰，赵萌莉，等.疯草及毒性成分研究进展［J］.草业科学，2011，20(3)：279-286.
GAO X L，HAN B，ZHAO M L，et al.Locoweed and advances in research on toxic components［J］.Pratacultural Science，2011，20(3)：279-286.（in Chinese）
［10］曹光荣，李绍君，段得贤,等.黄花棘豆有毒成分的分离与鉴定［J］.西北农业大学学报，1989，17(3)：1-8.
CAO G R，LI S J，DUAN D X，et al.The isolation and identification of toxic components from Oxytropis ochrochphala［J］.Journal of Northwest A & F University,1989，17(3):1-8.（in Chinese）
［11］余永涛.产苦马豆素疯草内生真菌的分离鉴定及其遗传多态性研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2009.
YU Y T.Isolation，identification and genetic polymorphism of swainsonine-producing fungal endophytes from locoweeds in China［D］.Yangling：Northwest A＆F University,2009.（in Chinese）
［12］余永涛,王建华,王妍,等.西藏3种疯草中合成苦马豆素内生真菌的鉴定［J］.中国农业科学，2009，42(10)：3662-3671.
YU Y T，WANG J H，WANG Y，et al.Identification of swainsonine-producing fungal endophytes from three species of locoweeds in Tibet［J］.Scientia Agricultura Sinica, 2009，42(10)：3662-3671.（in Chinese）
［13］余永涛，王建华，赵清梅，等.甘肃棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离与鉴定［J］.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2009，37(2)：40-46，51.
YU Y T，WANG J H，ZHAO Q M，et al.Isolation and identification of swainsonine-producing fungal endophyte from Oxytropis kansuensis［J］.Journal of Northwest A＆F University(Natural Science Edition)，2009，37(2):40-46,51.（in Chinese）
［14］YU Y T，ZHAO Q M，WANG J N，et al.Swainsonine-producing fungal endophytes from major locoweed species in China［J］.Toxicon，2010，56(3)：330-338.
［15］BRAUN K，COOK T，LIDDELLC M.Locoism of cattle caused by a species of Alternaria［J］.Phytopathology，1997，87：S11-S12.
［16］BRAUN K.Fungal endophyte infection and swainsonine toxi city in locoweed［D］.Las Cruces，N.M ：New Mexico State University，1999.
［17］BRAUN K，ROMERO J，LIDDELL C，et al.Production of swainsonine by fungal endophytes of locoweed［J］.Mycol Res，2003，107(8)：980-988.
［18］WANG Q，NAGAO H，LI Y，et al.Embellisia oxytropis，a new species isolated from Oxytropis kansuensis in China［J］. Mycotaxon，2006，95：255-260.
［19］卢萍.内蒙古三种棘豆属植物中苦马豆素相关因子的研究［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2007.
LU P.Factors related to swainsonine in three Oxytropis species in Inner Mongolia［D］.Huhehaote：Inner Mongolia Agricultural University，2007.（in Chinese）
［20］PRYOR B，CREAMER R，SHOEMAKER R，et al.Undifilum，a new genus for endophytic Embellisia oxytropis and parasitic Helminthosporium bornmuelleri on legumes［J］.Botany，2009，87(2)：178-194.
［21］OLDRUP E，MCLAINROMERO J，PADILLA A,et al.Localization of endophytic Undifilum fungi in locoweed seed and influence of environmental parameters on a locoweed in vitro culture system［J］.Botany，2010，88(5)：512-521.
［22］HARRIS T M，HARRIS C M，HILL J E，et al.(1S,2R,8aS)-1,2-Dihydroxyindolizidine formation by Rhizoctonia leguminicola，the fungus that produces slaframine and swainsonine［J］.J Org Chem，1987，52(14)：3094-3098.
［23］HARRIS C M，SCHNEIDER M J，UNGERMACH F S，et al.Biosynthesis of the toxic indolizidine alkaloids slaframine and swainsonine in Rhizoctonia leguminicola：metabolism of 1-hydroxyindolizidines［J］.J Am Chem Soc，1988，110(3)：940-949.
［24］HARRIS C，CAMPBELL B，MOLYNEUX R，et al.Biosynthesis of swainsonine in the Diablo locoweed(Astragalus oxyphysus)［J］.Tetrahedron Lett，1988a，29(38)：4815-4818.
［25］WICKWIRE B M，HARRIS C M，HARRIS T M，et al.Pipecolic acid biosynthesis in Rhizoctonia leguminicola.I.The lysine saccharopine，delta 1-piperideine-6-carboxylic acid pathway［J］.J Biol Chem，1990，265(25):14742-14747.
［26］WICKWIRE B M，WAGNER C，BROQUIST H P.Pipecolic acid biosynthesis in Rhizoctonia leguminicola.II.Saccharopine oxidase：a unique flavin enzyme involved in pipecolic acid biosynthesis［J］.J Biol Chem，1990，265(25):14748-14753.
［27］路宏朝,杨鸣琦,朱晓飞,等.金龟子绿僵菌发酵代谢物中苦马豆素的初步研究［J］.西北农业学报，2006，15(4)：70-72.
LU H Z，YANG M Q，ZHU X F，et al.Preliminary study of swainsoine from metabolism products of the Metarhizium anisopliae ［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2006，15(4)：70-72.（in Chinese）
［28］SIM K，PERRY D.Analysis of swainsonine and its early metabolic precursors in cultures of Metarhizium anisopliae［J］.Glycoconj J，1997，14：661-668.
［29］李海利.产苦马豆素疯草内生真菌蛋白质双向电泳及蛋白质组学研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2012.
LI H L.Studies on the two-dimensional gel electrophoresis and proteomic of locoweed endophytic fungi synthesizing swainsonine［D］.Yangling：Northwest A＆F University,2012.（in Chinese）
［30］MUKHERJEE S，DAWE A L，CREAMER R.Potential role for saccharopine reductase in swainsonine metabolism in endophytic fungus，Undifilum oxytropis［J］.Fungal Biol，2012，116(8)：902-909.
［31］MUKHERJEE S，DAWE A L，CREAMER R.Development of a transformation system in the swainsonine producing，slow growing endophytic fungus，Undifilum oxytropis［J］.J Microbiol Meth，2010，81(2)：160-165.
［32］杨国栋.疯草内生真菌合成苦马豆素的研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2012.
YANG G D.Study on biosynthesis of swainsonine by the locoweed’s endophytic fungi［D］.Yangling：Northwest A＆F University,2012.（in Chinese）
［33］OLDRUP W E.Determining the influence of environmental parameters on swainsonine production in Oxytropis sericea and its fungal endophyte［D］.Las Cruces：New Mexico State University，2005.
［34］张蕾蕾，何生虎，余永涛，等.宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离及鉴定［J］.中国畜牧兽医，2013，40(12)：77-84.
ZHANG L L，HE S H，YU Y T，et al.Isolation and identification of swainsonine-producing fungal endophyte from Oxytropis ochrocephala Bunge in Ningxia［J］.China Amimal Husbandry & Veterinary Medicine，2013，40(12):77-84.（in Chinese）
［35］张静，崔颖，孙尧，等.不同程度干旱胁迫对油菜种子萌发及幼苗生长特性的影响［J］.干旱地区农业研究，2011，29(2)：164-167.
ZHANG J，CUI Y，SUN X，et al.Effect of different degree of drought stress on germination and seedling growth of rapeseed (Brassica napus L.)［J］.Agricultural Research in the Arid Areas，2011，29(2)：164-167.（in Chinese）
［36］丁振，贾士儒，王文哲，等.聚乙二醇(PEG) 模拟干旱胁迫对液体悬浮培养发状念珠蓝细菌生长及生理生化的影响［J］.中国酿造，2012，31(8)：82-84.
DING Z，JIA S R，WANG W Z，et al.Response of Nostoc flagelliforme in liquid suspension culture to polyethylene glycol (PEG) simulated drought stress［J］.China Brewing，2012，31(8):82-84.（in Chinese）
［37］RALPHS M H，CREAMER R，BAUCOM D，et al.Relationship between the endophyte Embellisia spp.and the toxic alkaloid swainsonine in major locoweed species(Astragalus and Oxytropis)［J］.J Chem Ecol，2008，34(1)：32-38.
［38］COOK D，GARDNER D R，RALPHS M H，et al.Swainsonine concentrations and endophyte amounts of Undifilum oxytropis in different plant parts of Oxytropis sericea［J］.J Chem Ecol，2009，35(10)：1272-1278.
［39］COOK D，GARDNER D R，GRUM D，et al.Swainsonine and endophyte relationships in Astragalus mollissimus and Astragalus lentiginosus［J］.J Agric Food Chem，2011，59(4)：1281-1287.
［40］RALPHS M H，COOK D，GARDNER D R，et al.Transmission of the locoweed endophyte to the next generation of plants［J］.Fungal Ecol，2011，4(4)：251-255.
［41］袁志林，章初龙，林福呈.植物与内生真菌互作的生理与分子机制研究进展［J］.生态学报，2008，28(9)：4431-4438.
YUAN Z L，ZHANG C L，LIN F C.Recent advances on physiological and molecular basis of fungal endophyte-plant interactions ［J］. Acta Ecologica Sinica，2008,28(9)：4431-4438.（in Chinese）
［42］TAMERLER C，ULLAH M，ADLARD M W，et al.Effect of pH on physiology of Metarhizium anisopliae for production of swaisonine［J］.FEMS Microbiol Lett，1998，168(1)：17-23.
［43］熊强，徐晴，顾帅，等.丝状真菌形态控制及其在发酵过程优化中的应用［J］.生物工程学报，2012，28(2)：178-190.
XIONG Q，XU J，GU S，et al.Controlling the morphology of filamentous fungi for optimization of fermentation process ［J］.Chinese Journal of Biotechnology，2012，28(2):178-190.（in Chinese）

[1]	郝宝成, 宋向东, 高艳, 王学红, 刘宇, 陈柯源, 梁妍, 胡毓瑶, 邢小勇, 温峰琴, 胡永浩, 梁剑平. 利用亚硝基胍诱变和高通量测序技术分析疯草内生真菌产SW生物合成通路[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(1): 169-182.
[2]	郝宝成, 宋向东, 高艳, 王学红, 刘宇, 陈柯源, 梁妍, 胡毓瑶, 邢小勇, 温峰琴, 胡永浩, 梁剑平. 利用亚硝基胍诱变和高通量测序技术分析疯草内生真菌产SW生物合成通路[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(1): 169-182.
[3]	孙璐, 任祯慧, 宋润杰, 权海云, 焦韵洁, 黄竹涛, 王敬龙, 赵宝玉, 路浩. 毛序棘豆内生真菌分离鉴定及系统进化分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(9): 2025-2035.
[4]	孙璐, 任祯慧, 宋润杰, 权海云, 焦韵洁, 黄竹涛, 王敬龙, 赵宝玉, 路浩. 毛序棘豆内生真菌分离鉴定及系统进化分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(9): 2025-2035.
[5]	余永涛, 李金荣, 赵清梅, 何生虎, 陈娟, 杨奇, 毛彦妮. 直立黄芪中产苦马豆素真菌的分离与鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(8): 1770-1780.
[6]	余永涛, 李金荣, 赵清梅, 何生虎, 陈娟, 杨奇, 毛彦妮. 直立黄芪中产苦马豆素真菌的分离与鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(8): 1770-1780.
[7]	孙丽, 宗秋芳, 吴森, 吴嘉韵, 吴圣龙, 包文斌. 猪FUT2基因沉默对其所在通路基因表达及小肠上皮细胞E.coli F18黏附能力的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(11): 2034-2045.
[8]	孙丽, 宗秋芳, 吴森, 吴嘉韵, 吴圣龙, 包文斌. 猪FUT2基因沉默对其所在通路基因表达及小肠上皮细胞E.coli F18黏附能力的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(11): 2034-2045.
[9]	王欢，路浩，郭亚洲，冯柯，耿朋帅，赵宝玉. 瑞香狼毒内生真菌的分离与鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(8): 1696-1703.
[10]	王丽娜，王珍，彭建龙，王建兵，杨柯林，束刚，王松波，朱晓彤，高萍，江青艳. 表没食子儿茶素没食子酸酯对育肥猪骨骼肌纤维类型的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(8): 1581-1591.
[11]	王丽娜，王珍，彭建龙，王建兵，杨柯林，束刚，王松波，朱晓彤，高萍，江青艳. 表没食子儿茶素没食子酸酯对育肥猪骨骼肌纤维类型的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(8): 1581-1591.
[12]	王欢，路浩，郭亚洲，冯柯，耿朋帅，赵宝玉. 瑞香狼毒内生真菌的分离与鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(8): 1696-1703.
[13]	黄鑫，梁剑平，高旭东，郝宝成. 苦马豆素的来源、药理作用及检测方法研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(6): 1075-1085.
[14]	黄鑫，梁剑平，高旭东，郝宝成. 苦马豆素的来源、药理作用及检测方法研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(6): 1075-1085.
[15]	张蕾蕾，余永涛，何生虎，赵清梅，葛松. 不同因素对疯草内生真菌合成苦马豆素的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(1): 163-173.