猪星状病毒SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

畜牧兽医学报 ›› 2010, Vol. 41 ›› Issue (8): 1049-1053.

猪星状病毒SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

商晓桂^1,2，郭伟^1,2，杨莲茹²，杨志彪¹，华修国¹*，朱建国¹，崔立¹

1. 上海交通大学农业与生物学院，上海200240；2. 内蒙古农业大学动物医学与科学学院，呼和浩特 010018

收稿日期:1900-01-01 修回日期:1900-01-01 出版日期:2010-08-20 发布日期:2010-08-20
通讯作者: 华修国

Development and Application of SYBR Green Ⅰ Real-time PCRTechnique for Detecting Porcine Astrovirus

SHANG Xiao-gui^1,2, GUO Wei^1,2, YANG Lian-ru², YANG Zhi-biao¹, HUA Xiu-guo¹*, ZHU Jian-guo¹, CUI Li¹

1. Zoonosis and Comparative Medicine Group, Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240, China; 2.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China

Received:1900-01-01 Revised:1900-01-01 Online:2010-08-20 Published:2010-08-20

摘要/Abstract

摘要： 本研究旨在建立一种能够快速、简便、灵敏地检测猪星状病毒的基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。根据已报道的猪星状病毒ORF2基因序列，设计并合成1对引物，通过PCR扩增ORF2基因片段，将测序正确的ORF2基因片段克隆入pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α，经测序鉴定后得到阳性重组质粒，作为标准品模板建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线，并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明，猪星状病毒荧光定量PCR的标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系，熔解曲线特异，灵敏度可达1×101拷贝，是普通PCR检测方法的100倍，特异性和重复性较好。本次建立的猪星状病毒荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、敏感等优点，有重要的实用价值。

关键词: SYBR Green Ⅰ, 猪星状病毒, 检测

Abstract: The aim of this study was to develop a SYBR Green Ⅰ real-time quantitative PCR for detecting porcine astrovirus(PASTV) quickly and flexibly. According to genome sequences within ORF2 of PASTV published in GenBank, a pair of primers was designed. The fragment of ORF2 gene was amplified with traditional PCR. The PCR product was cloned into pMD18-T vector and sequenced. The positive recombinant plasmid was used as quantitative template to generate standard curve and melt curve. Sensitivity assay, reproducibility of the assay and specificity assay were determined. The results demonstrated that standard curve established by recombinant plasmid shown a fine linear relationship between threshold cycle and template concentration. Melt curve was specific and the correlation coefficient was 0.994; the detection limit of real-time PCR for PASTV was 1×101 copies, and the quantitative PCR was more reproductive and specific than traditional PCR. These results indicated that the SYBR Green Ⅰ fluorescent quantitative PCR for detecting PASTV was developed for the basis of the early and rapid detection and analyzing the infect degree of PASTV quantitatively.

Key words: SYBR Green Ⅰ, porcine astrovirus, detection

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