在骨骼发育过程中,骨骼是通过膜内成骨和软骨内成骨两种不同的成骨机制形成的,软骨内骨化是长骨发育的第二阶段,生长板是机体进行软骨内骨化的场所,生长板软骨细胞受损会破坏软骨内成骨的进程,严重抑制骨骼发育或产生骨骼疾病。外泌体是由膜的双层内陷形成,具有脂质双分子层的细胞外囊泡,可以包裹蛋白质、脂质和核酸(非编码RNA、mRNA)等,作用于靶细胞从而发挥细胞间通讯的关键作用。外泌体作为近年来研究的热点,有大量研究发现其与骨骼发育、骨骼疾病的发生和治疗关系密切。因此,本文主要综述了不同来源外泌体对骨骼发育和骨骼疾病的影响,梳理了不同来源外泌体对骨骼的调控作用,为探究不同来源外泌体在畜禽骨骼发育与骨骼疾病方面的预防和治疗提供理论依据。

哺乳动物性别控制(sex control)技术在畜牧生产中有着重要的意义,在畜牧生产实践中,通过性别控制技术人类可以获得预想性别的优秀家畜后代,从而使家畜的泌乳性能、繁殖性能和生产性能发挥到最大。目前,传统的哺乳动物性别控制技术主要分为两类:受精前X/Y精子分离技术和受精后早期胚胎性别鉴定。这些方法都有各自的特点和局限性,如处理时间长、分离效率低、对精子活力和胚胎发育有损伤等,因此,这些技术有待进一步优化和完善。本文总结并分析了哺乳动物的传统性控技术,简述其各自特点及存在的问题。此外,利用激活Toll样受体7和Toll样受体8分离X/Y精子的新技术引起了广泛关注,与传统方法相比,该方法无需添加外源药物,具有高效、快速、无毒副作用等优点。尽管该技术已经成功应用于小鼠、羊、牛等动物的性别控制中,但在大规模应用上仍有一些问题需要进一步解决。本文总结了该技术的研究进展,分析了目前将该方法应用于实际生产中的可行性,并对该技术未来的发展趋势进行展望。

我国是世界上最大的生猪生产国和猪肉消费国,但仍存在着母系猪繁殖力普遍较低的重要问题,选育具有高繁殖性状的母系猪已成为当前研究的焦点和热点。目前,已明确多个影响母猪产仔数的已知基因,包括雌激素受体(estrogen receptors, ESR)基因、泌乳素受体(prolactin receptor, PRLR)基因、视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein 4, RBP4)基因、瘦素(leptin, LEP)基因、备解素(complement factor b, BF)基因、胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding protein, IGFBP)基因、连环蛋白阿尔法样蛋白1(catenin alpha-like protein 1, CTNNAL1)、无翼型MMTV结合位点家族10B(wingless-type mmtv integration site family member 10B, WNT10B)基因、转录因子12(transcription factor 12, TCF12)基因、无精症样删除基因家族(deleted in azoospermia-like, DAZL)、无名指蛋白4(ring finger protein 4, RNF4)基因以及骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)家族等基因。这些基因通过复杂的相互作用网络影响母猪的繁殖力性状表现,但少数几个基因的位点效应对母猪的繁殖力表型影响较为有限,因此在母猪繁殖性能方面的育种遗传进展相对较小。全基因组关联分析(genome-wide association studies, GWAS)技术基于全基因组策略,利用覆盖全基因组的遗传标记信息,分析整个基因组中的全部遗传变异多态性作为分子遗传标记,并与表型和系谱信息进行对照和统计分析,从而加速了重要单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点、数量性状位点(quantitative trait locus, QTLs)和候选基因的发现过程。全基因组选育(genomic selection, GS)利用系谱信息、表型数据以及全基因组的SNP分型信息,为母猪繁殖性能等低遗传力性状的育种工作提供了更快速、准确的个体全基因组估计育种值(genomic estimated breeding value, GEBV),从而显著加快了育种遗传进展。

奶牛早期胚胎死亡导致的妊娠失败,可造成奶牛场巨大的经济损失。对未妊娠奶牛进行及早且准确的妊娠诊断,将提高奶牛妊娠效率,缩短空怀天数。本文综述了近年来国内外有关妊娠相关蛋白、奶牛早期妊娠阶段血液、尿液、乳液等体液蛋白及蛋白组学研究,以确认早期未妊娠的潜在蛋白,从而在妊娠早期对奶牛进行准确的妊娠诊断,提高奶牛的生产效益。

铜死亡是最近新发现的一种调节性细胞死亡(regulated cell death,RCD)形式。这种死亡形式的主要原因是细胞内铜离子的聚集,这个过程靶向干扰三羧酸循环。虽然已有学者阐明了其基本分子机制,但是对于铜死亡的研究仍然存在许多需要探索的方面。相比之下,对铁离子过载诱导的铁死亡的研究已相对完善,本文以铁死亡研究为参照,对两种金属离子诱导的细胞死亡进行了全面综述。

猫犬过敏原可引发症状严重程度不一的过敏反应,诱发人类鼻炎和哮喘等,危害严重。在犬猫的皮屑、毛发、唾液、舌下腺等提取物中发现有多种致敏原。在很多公共场所(如医院、学校、办公室等)检测到的过敏原浓度足以引发过敏性疾病或者使症状加重,这些症状困扰着爱猫犬人士。目前,针对猫犬过敏最有效的治疗方法依然是过敏原特异性免疫疗法。本综述主要对当前犬猫过敏原的种类、异源表达、治疗方法的研究进展进行总结,并对过敏制剂的应用进行了展望,这为解决犬猫过敏症这一难题提供了新的思路。

A型流感病毒(influenza A virus, IAV)是一种呼吸道病原体,可诱导宿主发生炎症反应,促进炎症细胞聚集,释放大量趋化因子、细胞因子以及转录因子等炎症因子,引起宿主过度炎症,导致细胞死亡和组织损伤。IAV编码的多种蛋白质可通过不同的机制参与宿主炎症反应,大大增加IAV感染的发病率和死亡率。越来越多的研究表明,免疫调节策略可以在不影响宿主抵抗感染的情况下改善疾病预后。本文综述了IAV引发炎症反应的最新进展,以便为临床治疗IAV提供新思路。

佐剂是指添加到疫苗中以刺激和增强免疫应答强度或改变免疫应答类型的物质。目前疫苗佐剂种类较多,包括铝佐剂、油乳佐剂和脂质体佐剂等,但临床使用的佐剂很少同时具备高效和低毒两大特点,因此迫切需要一种有效且安全的佐剂。基于碳水化合物的佐剂具有良好的生物相容性和易代谢的优点,同时,基于碳水化合物的佐剂种类广泛,且每种都有不同免疫特性,如基于多糖的佐剂可以增强巨噬细胞的吞噬活性及抗原提呈能力等。并且基于碳水化合物的佐剂还可与Toll样受体、C型凝集素受体等多种受体结合发挥上述免疫活性,但其作用机制尚不完全清楚。故本文基于碳水化合物的佐剂作用机制相关研究进展进行总结梳理,以期为相关佐剂的进一步研究提供参考。

旨在通过研究文昌鸡进化过程的特征,深入理解影响产蛋性能的因素,为文昌鸡优良品种选育提供基础。本研究采集35只健康文昌鸡(35周龄,15公,20母)和30只健康江汉鸡(35周龄,10公,20母)的血液组织各3 mL提取DNA,采用全基因组重测序方法建库测序。首先,对于原始测序数据用trimmomatic 软件过滤,获得高质量序列比对到鸡的参考基因组,GATK软件提取变异位点SNPs,设置参数质控去除低质量、假阳性变异位点,进一步采用snpEff对过滤的SNPs进行基因结构和功能注释。然后,比较文昌鸡和江汉鸡的群体结构差异,分别设置评估群体差异参数Fst、ROD、Tajima's D的阈值,筛选受到选择的区域,并对这些区域的基因进行功能富集。结果表明:1)文昌鸡测序获得1.05 Tb clean data,平均每个样本大约29.97 Gb,测序深度大约28×;江汉鸡测序获得1.10 Tb clean data,每个样本大约36.72 Gb,测序深度大约35×;平均比对率>98%。2)两个群体基因结构注释总数均是内含子>基因间区>上下游调控区>编码区;系统进化树和主成分分析显示文昌鸡和江汉鸡亲缘关系较远;文昌鸡的连锁不平衡程度低于江汉鸡。3)与产蛋性能相关基因的功能富集结果主要包括3种必须氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)代谢途径、钙离子沉积、金属肽酶抗氧化、肾上腺素和催乳素受体活性等功能,而且这些通路的基因都位于受到强烈选择的区域。综上所述,影响文昌鸡产蛋性能的因素主要包括必须氨基酸代谢、矿物质沉积和抗氧化、性腺激素分泌,这3个因素在进化过程中都受到强烈选择,对产蛋性能发挥重要调控作用。从进化分子遗传学角度研究鸡的产蛋机理,不但能够促进理解文昌鸡产蛋性能的进化特征,而且有助于加速高产蛋鸡品种或品系的培育。

旨在探讨半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)对体外培养燕山绒山羊次级毛囊(SF)生长及毛乳头细胞(DPCs)增殖凋亡的影响。本研究选取1只1周岁左右健康雄性燕山绒山羊皮肤若干,完整分离的次级毛囊随机分成Cys试验组和Met试验组,每组各浓度3个重复,每个重复8根毛囊,Cys试验组添加浓度分别为0、40、80、120、160和200 μg·mL^-1;Met试验组添加浓度分别为0、10、15、20、25和30 μg·mL^-1。毛囊培养7 d,每隔24 h观察毛囊生长形态并测量毛囊生长长度。从燕山绒山羊次级毛囊中提取、纯化DPCs,细胞计数并绘制DPCs生长曲线,将DPCs随机分为Cys试验组和Met试验组,每组各浓度6个重复,Cys试验组添加浓度分别为0、20、40、60、80、100 μg·mL^-1;Met试验组添加浓度分别为0、2、4、6、8、10 μg·mL^-1。培养2 h后用CCK-8试剂盒进行细胞增殖活力测定,确定燕山绒山羊DPCs中Cys和Met的最适培养浓度,利用qRT-PCR技术检测不同浓度Cys和Met的DPCs增殖相关基因(PCNA、CCND1、CDC42、CDK4)、凋亡相关基因(P21、P53、Bax、Caspase-3、Bcl-2)、皮肤细胞分化相关基因(IVL)及角蛋白相关基因(K10、K14)mRNA表达水平。结果表明,与对照组相比,添加80和120 μg·mL^-1 Cys与10、15、20和25 μg·mL^-1 Met均可显著影响次级毛囊生长速率和累计生长长度(P<0.01),且120 μg·mL^-1 Cys和20 μg·mL^-1 Met促生长效果最好;添加20、40和60 μg·mL^-1 Cys可以显著影响DPCs增殖(P<0.05),添加40 μg·mL^-1Cys显著上调PCNA、CCND1、CDK4、Bcl-2、K10、K14和IVL基因mRNA表达量(P<0.05);添加6 μg·mL^-1 Met可以显著影响DPCs增殖(P<0.05),并显著上调PCNA、CCND1、CDK4、P21、Bcl-2、K10和K14基因mRNA表达量(P<0.05)。综上,添加Cys和Met可以显著促进长绒期燕山绒山羊次级毛囊生长,最适添加量分别为120 μg·mL^-1和20 μg·mL^-1;添加Cys和Met可通过上调细胞增殖、分化、角蛋白等基因mRNA、下调细胞凋亡基因mRNA表达,促进乳头细胞增殖、抑制细胞凋亡进而促进燕山绒山羊次级毛囊生长。

旨在运用加权基因共表达网络分析技术(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)筛选出荷斯坦奶牛(Bos taurus)肝脏组织中与泌乳时期及繁殖力相关的基因。本研究采用GEO数据库中的GSE62159数据集,该数据集分别包含高繁殖力(分泌到配种的平均时间间隔为85.6 d,n=24)和低繁殖力(分泌到配种的平均时间间隔为113.8 d,n=24)健康荷斯坦母牛在妊娠后期、泌乳初期和泌乳中期的肝脏组织转录组数据,使用R语言中的WGCNA包对该数据集进行共表达分析。将所得到的模块与不同泌乳时期以及不同繁殖力进行关联分析,得到目标模块,再依据连接度选择出排名前30的基因作为枢纽基因(Hub 基因),对Hub基因进行功能富集分析,使用String网站构建出模块的蛋白互作网络(PPI),并使用Cytoscape软件筛选出Hub基因与蛋白互作分析(PPI)网络核心基因的交集,最终得到肝脏中与泌乳时期及繁殖力相关的目标基因。研究共得到14个模块,其中tan、greenyellow两个模块与泌乳时期相关,black模块与繁殖力相关。对hub基因进行富集分析后,发现肝脏中与泌乳早期相关基因功能主要包括:有物质的合成代谢途径、脂质脂蛋白的基因表达、蛋白质的合成到分泌等;与泌乳中期相关基因功能主要包括:疾病、机体的炎症反应、免疫反应以及急性期等;与繁殖力相关基因功能主要包括:胰岛素抵抗、子宫内膜癌以及癌症等。筛选到的12个肝脏中与泌乳早期相关的目标基因有RPN1、SEC61A1、SEC61B、SEC61G、SSR1、SSR3、STT3A、DAD1、DDOST、ERLEC1、HM13和OSTC;6个与泌乳中期相关的目标基因有ITGAL、ITGB2、LAPTM5、PTPRC、C3AR1和CTSS;4个与繁殖力相关的目标基因有:PDS5A、ROCK1、AQR和LTN1。本研究使用WGCNA、PPI、基因功能富集等生物信息学方法,鉴定得到荷斯坦奶牛肝脏中与泌乳时期、繁殖力相关的目标基因,并对目标基因进行了功能富集分析,为高繁殖力及高产奶牛培育方向的科研工作积累了理论资料。

本研究利用荷斯坦牛肺间质干细胞(LR-MSCs),通过体外试验观察LR-MSCs在不同条件下的成骨分化能力,以期为临床应用及组织工程提供新的种子细胞。本项目以荷斯坦牛(健康荷斯坦牛胎牛,0日龄,1只,雄性)为对象,通过无菌方法获得肺组织,通过组织块贴壁方法获得LR-MSCs,并将其原代培养。通过绘制3代、9代、15代细胞的生长曲线,测定其增殖时间及成体能力。利用RT-PCR技术对干细胞表面标志物(CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166、CD34和CD45)的表达进行检测。对该基因进行染色体核型分析,并对其进行遗传转化,观察该基因的多向性。结果显示,这种方法能获得LR-MSCs,它们在体外培养时表现为长梭形和螺旋形,并呈现典型的"S"曲线。第9世代的倍增时间比15世代的短,但比3世代的长(P<0.01);第9代LR-MSCs的成株率较3代明显降低,而15代较高,差异有统计学意义(P<0.05)。应用RT-PCR技术检测到在LR-MSCs中特异表达的CD29、CD44、CD73、CD90。前期研究发现,LR-MSCs可特异性地表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166,而CD34、CD45则不表达。对LR-MSCs进行染色体组测序,发现其为正常二倍体(2n=60,XY)。通过对荷斯坦牛LR-MSCs的免疫荧光染色及RT-PCR分析,证明LR-MSCs具有向脂肪、骨、软骨等多种细胞定向分化的能力。这可能为今后的组织工程研究提供了一种新的种子细胞。

本研究以溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)在卵丘细胞扩张中的作用为切入点,旨在探讨不同浓度LPA对牦牛卵丘细胞(yak cumulus cells, YCCs)中卵丘扩张因子(透明质酸合成酶2(hyaluronate synthase 2, HAS2)、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)和正五聚蛋白3(pentraxin 3, PTX3))表达的影响。本研究以健康成年(3~4岁)雌牦牛的YCCs为研究对象,取对数生长期的YCCs,将不同浓度的LPA(空白对照、阴性对照、5 、15 、30和50 μmol·L^-1)作用于体外培养的YCCs,分别培养12、24、36、48 h后,CCK-8检测YCCs的细胞活性,采用RT-qPCR和Western-blot法检测YCCs中HAS2、PTGS2和PTX3 mRNA和蛋白相对表达量,细胞免疫荧光染色法检测卵丘扩张因子HAS2、PTGS2和PTX3在YCCs中的分布。试验中每个处理组3个重复。结果显示,LPA孵育12、24、36和48 h,对YCCs的活性有着明显的促进作用。当孵育时间为24 h时,LPA对YCCs活性的促进作用最明显。相比较于对照组而言,当LPA浓度为15 μmol·L^-1时,不同孵育时间中YCCs的活性提升最为显著(P<0.05)。当LPA浓度为15 μmol·L^-1时,与空白对照组相比,HAS2、PTGS2和PTX3的mRNA和蛋白相对表达量最高(P<0.05),且YCCs中HAS2、PTGS2和PTX3的荧光强度明显增强。当LPA浓度大于15 μmol·L^-1时,HAS2、PTGS2和PTX3的mRNA和蛋白相对表达量逐渐下降。本研究表明,LPA对YCCs活性具有促进作用。当孵育时间为24 h,并且LPA浓度为15 μmol·L^-1时,活性提升最为显著(P<0.05)。LPA可以增强YCCs中卵丘扩张因子HAS2、PTGS2、PTX3的表达,且其作用浓度具有剂量依赖性,最佳浓度为15 μmol·L^-1。研究结果为阐明LPA促进牦牛卵丘细胞扩张的分子机制提供了理论依据,为进一步提高牦牛卵母细胞的质量和体外受精(in vitro fertilization, IVF)成功率提供理论基础。

旨在获得新西兰白兔 BMP15基因序列及其组织表达规律,构建其真核表达载体,预测BMP15的生物学功能。本研究选择180日龄性成熟的健康新西兰白兔作为研究对象,采用 RT-PCR 技术扩增BMP15 基因CDS区序列,利用T4连接方法将目的片段连接至线性化的Pmcherry-N1和pCMV-Myc空载体,构建真核表达载体,利用生物信息学分析其编码蛋白的性质及结构。采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 技术与Western blotting技术检测pCMV-Myc-BMP15过表达情况。接下来,使用qRT-PCR检测BMP15 基因在不同组织中的表达水平。激光共聚焦方法检测BMP15基因的亚细胞定位。利用免疫荧光技术检测内源BMP15在新西兰白兔卵巢组织定位情况。结果表明:克隆得到新西兰白兔BMP15基因CDS区序列长1 182 bp , PCR及测序结果表明pCMV-Myc-BMP15和 Pmcherry-N1-BMP15真核表达载体构建成功。生物信息学分析显示,BMP15基因编码393个氨基酸;BMP15蛋白不稳定系数为55.32,等电点大小为9.69 ,是一种稳定的碱性蛋白质。BMP15蛋白共有26个磷酸化位点,15个糖基化位点,存在信号肽,不存在跨膜结构域。系统进化树表明,新西兰白兔与猪亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。二级结构和三级结构分析结果表明,BMP15蛋白主要由α-螺旋(38.68%)、无规则卷曲(37.4%)、延伸链(15.52%)、β-转角(8.40%)组成, 为混合型蛋白。蛋白互作关系预测发现,BMP15蛋白与FSHR、FIGLA、BMPR1B、AMHR2、NOBOX等卵巢生长发育的相关蛋白之间存在相互作用。不同组织表达分析显示,BMP15 基因在卵巢组织中特异性表达;激光共聚焦结果显示,BMP15 主要存在于在细胞质中。将pCMV-Myc-BMP15转染至HEK293T细胞内,BMP15的mRNA水平和蛋白水平均显著上调。卵巢组织免疫荧光检测结果显示,BMP15主要定位在卵巢颗粒细胞的细胞质中。本研究成功构建了BMP15的真核表达载体,对BMP15基因及其编码的蛋白的理化性质和生物学特性进行了预测分析,在HEK293T细胞内成功过表达,并得到了该基因的亚细胞定位情况、组织表达情况及在卵巢组织的分布情况。为后续开展BMP15基因在卵巢生长发育中的功能及机制研究提供了理论依据。

旨在分析卵泡液外泌体对卵巢颗粒细胞基因的影响,了解卵泡液外泌体在卵泡发育过程中的调控机理,为母猪繁殖研究提供理论依据。本研究选取6月龄、健康状态良好且体重相近的二元母猪为材料,屠宰后收集卵巢150枚,利用梯度离心法获取卵泡液外泌体与猪卵巢颗粒细胞(porcine ovarian granulosa cells,POGCs),并在体外将卵泡液外泌体与猪卵巢颗粒细胞共培养。通过RNA-seq技术对猪卵巢颗粒细胞(granulosa cell samples,GC,n=3)和与外泌体共培养的猪卵巢颗粒细胞(granulosa-exosome co-culture samples,GCE,n=3)进行测序。结果显示,在GC和GCE组中平均每个样品获得5.54×10⁷ 条clean reads,Q20和Q30质量得分均在92%以上。在GC和GCE组的6个样品中共获得1 310 979个SNPs突变和104 498个InDel突变,其中纯合型SNP/Indel突变数量为170 426个,杂合型SNP/Indel突变数量为1 245 052个,突变杂合子数目明显高于纯合子且SNP的发生率较高。另外,在突变类型中,转换类型共计973 003个,颠换类型339 974个,转换的类型显著高于颠换类型。经基因注释,突变主要发生在基因3'UTR、5'UTR、内含子区域,其次为外显子和基因间隔区。另外,通过与差异基因对比后,够筛选出1 583个候选基因,经GO和KEGG功能富集发现,候选基因主要与细胞周期以及细胞增殖/凋亡过程相关。此外,共发现14个与细胞周期、增殖/凋亡通路相关的关键候选基因,其中11个基因存在互作关系。本研究获得的这些SNP/Indel信息可为后续研究外泌体在母猪生殖上的调控奠定科学基础。

旨在分析精氨酸及其代谢物在调节热应激诱导仔猪支持细胞凋亡中的作用。本试验选择3周龄健康雄性仔猪25只,采集睾丸并从中分离支持细胞,随机分为3组,每组3个重复。将体外培养的仔猪睾丸支持细胞在44℃条件下处理30 min作为热应激模型,质谱多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)氨基酸代谢物,添加外源精氨酸和精胺,运用流式细胞术检测细胞的凋亡率,使用Western blotting检测iNOS、BAX、FAS、ARG1,ODC 和 SSAT1的表达,通过荧光定量PCR检测Arg1、Arg2和 Odc mRNA 水平,通过试剂盒检测精胺水平。结果显示,热应激显著降低了精氨酸(P<0.01)和瓜氨酸(P<0.05)水平,提高了腐胺(P<0.05)和鸟氨酸(P<0.01)水平,但精胺(P>0.05)水平无显著变化;热应激也显著增加了Inos(P<0.01)、Arg1(P<0.01)、Arg2(P<0.01)和 Odc(P<0.05)mRNA的表达以及 NO(P<0.01)的含量并导致细胞凋亡率上升(P<0.01)。添加0.05 mmol·L^-1 外源精氨酸提高了热应激条件下 SCs 的活力(P<0.05)和精氨酸(P<0.01)含量,降低了BAX(P<0.05)和 FAS(P<0.05)蛋白水平和相对凋亡率(P<0.01),同时也显著降低了 iNOS(P<0.01)蛋白水平和 NO(P<0.01)含量,提高了精胺(P<0.01)含量,缓解了热应激下SCs的凋亡(P<0.01);添加外源精胺也得到了类似的结果。以上结果表明,热处理通过增强 Arg-NO 代谢途径诱导 SCs 凋亡;添加外源性精氨酸和精胺可增强 Arg-精胺代谢,减少NO 的产生,从而抑制热应激诱导的 SCs 细胞凋亡。

旨在探究可变剪接因子核不均一核糖核蛋白F(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F,hnRNPF)对蒙古马精子生成的影响。本研究提取并培养3岁性成熟蒙古马睾丸支持细胞;构建hnRNPF过表达慢病毒载体,将载体转染至蒙古马睾丸支持细胞中;每组3个重复,分别在转染0、24、48、72 h时利用CCK-8检测转染后细胞增殖情况并确定最佳转染时间;提取转染后与未转染的蒙古马睾丸支持细胞RNA,设计已知与精子生成相关基因的引物进行qRT-PCR试验,检测精子生成相关基因在两种细胞中的表达情况。琼脂糖凝胶电泳结果显示,hnRNPF慢病毒过表达载体构建成功;CCK-8检测发现,细胞经过表达慢病毒载体转染72 h后活性最高,并且转染后细胞活性要高于未转染细胞活性,说明hnRNPF过表达会促进蒙古马睾丸支持细胞的增殖;qRT-PCR结果显示,精子生成相关基因(PKMYT1、CDC25C、YWHAZ、BUB1、BTRC、CCNE1、CALM1、PLK1、REC8、MAPK3、ADCY7)在两种细胞中的表达量差异显著,均在转染hnRNPF过表达载体细胞中含量较高。本试验结果表明,剪接因子hnRNPF可能对于蒙古马精子生成具有直接或间接的促进作用,为提高蒙古马精子数量和精液品质提供了新的思路。

旨在探究外源褪黑激素(melatonin,MLT)影响水貂卵巢发育的分子机制。本研究随机选取相同饲养条件下、体重相似的200只3月龄健康白色雌性水貂,均分为试验组和对照组。试验组埋植1粒含MLT 18 mg·粒^-1的埋植剂,对照组埋植1粒不含MLT的空粒,当水貂处于准备配种期时随机采集试验组和对照组各4只水貂的卵巢,然后采用Trizol法进行总RNA提取,构建cDNA文库,并利用Illumina平台测序后进行生物信息学分析,对差异表达基因进行GO功能分类和KEGG通路注释,寻找MLT调控卵巢发育的相关候选基因和代谢通路。为进一步验证测序数据的可靠性,随机选取6个差异表达基因进行qPCR验证。转录组结果显示,试验组和对照组的SNPs位点均在120 000个以上,且均主要出现在基因区,两组的SNP突变类型均为转换型多于颠换型和杂合型;试验组与对照组相比,差异表达基因发生SE事件的数量最多;本试验共获得9 631个新基因,其中有1 323个、1 317个新基因分别注释到 TrEMBL 和NR数据库,注释比例明显高于其他数据。试验组与对照组相比共发现206个差异表达基因(其中有36个未被注释的基因),69个为上调基因,137个为下调基因;GO功能富集显示,共计7个差异表达基因富集于生殖过程;KEGG通路富集结果显示,共计7个差异表达基因富集于5条与繁殖相关的通路。综合GO功能分类和KEGG通路注释结果分析,共筛选得到4个与MLT影响卵巢发育相关的候选基因,均为上调基因,分别是KRT19、GSTT1、ALAS1和NR4A1。本研究通过对MLT埋植和未埋植MLT的准备配种期水貂卵巢进行转录组学分析,挖掘出MLT可能通过调节KRT19、GSTT1、ALAS1、NR4A1等基因促进卵巢发育,研究结果对水貂的育种工作提供了理论基础。

旨在改进美国油脂化学家协会(The American Oil Chemists' Society,简称AOCS)测定盐酸不溶灰分(AIA)标准方法的上样量和过滤介质,以简化测定步骤、提高测定精度,并通过AOCS改进法与AOCS标准方法测定AIA,比较两种方法的重复性、可加性及准确性,为准确评价肉鸡对饲粮的代谢能(AME)提供可靠的技术。本研究分为两个试验。试验一采用单因素完全随机设计,通过两种方法(AOCS改进法、AOCS标准方法)对6个样品(3个饲粮、3个排泄物)分3个批次测定AIA含量,比较两种测定方法的可重复性;然后,通过两种方法测定6个混合饲粮和6个混合排泄物样品AIA的实际含量,同时,根据混合饲粮和混合排泄物的组成及AIA含量得到其AIA的计算值,采用配对设计比较实测值与计算值的差异以检验两种测定方法的可加性。试验二采用配对试验设计,比较两种方法测定AIA计算13个饲粮AME与全收粪法测定AME的差值,验证两种方法评价饲粮AME的准确性。结果表明,AOCS改进法测定3个饲粮和3个排泄物AIA的总变异系数(TCV)分别在2.13%~5.83%和1.71%~2.83%,而AOCS标准方法测定上述样品AIA的TCV分别在4.69%~15.37%和1.50%~5.79%;AOCS改进法测定6个混合饲粮和混合排泄物AIA实测值和计算值的差值分别在0.004%~0.017%和0.002%~0.029%,而AOCS标准方法测定上述样品实测值和计算值的差值分别在0.037%~0.071%和0.015%~0.072%。AOCS改进法测定AIA评价饲粮AME与全收粪法AME测值相差在0.021~0.251 MJ·kg^-1 DM,而AOCS标准方法测定AIA评价饲粮AME与全收粪法AME测值相差0.025~1.799 MJ·kg^-1 DM。综上所述,从测定AIA的重复性、可加性及对AME测定值的准确性上,AOCS改进法均优于AOCS标准方法。

旨在探究饲粮中添加腐殖酸钠(sodium humate, HNa)对鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium, S. Typhimurium)感染肉鸡肝组织炎症和抗氧化能力的影响。选取健康的1日龄雄性爱拔益加(AA)肉鸡320只,随机分为5组,每组8个重复,每个重复8只鸡:对照组(CON组,基础饲粮)、模型组(ST组,基础饲粮)、低剂量HNa组(L-HNa组,基础饲粮+0.2 g·kg^-1 HNa)、中剂量HNa组(M-HNa组,基础饲粮+0.4 g·kg^-1 HNa)、高剂量HNa组(H-HNa组,基础饲粮+0.6 g·kg^-1 HNa)。在试验第22~24天,CON组肉鸡每天灌胃1 mL PBS,ST、L-HNa、M-HNa和H-HNa组肉鸡每天灌胃1 mL 3×10⁹ CFU·mL^-1 的S. Typhimurium,试验周期24 d。结果显示:1)与ST组相比,饲粮中添加0.6 g·kg^-1的HNa显著提高了肉鸡的平均日增重(P<0.05)。2)与CON组相比,ST组肉鸡肝组织表现为大量炎性细胞浸润,肝脏指数增加,饲粮中添加不同浓度的HNa均缓解了肝组织的病理学损伤(P<0.05)。3)ST组肉鸡血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(AKP)的活性显著高于CON组(P<0.05);相较于ST组,L-HNa、M-HNa和H-HNa组肉鸡血清中AKP、ALT和AST的活性显著降低(P<0.05)。4)与CON组相比,ST组肉鸡肝组织过氧化氢酶(CAT)活性、总抗氧化能力(T-AOC)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性显著降低,丙二醛(MDA)含量显著升高(P<0.05);饲粮中添加HNa缓解了S. Typhimurium感染对肉鸡肝组织抗氧化功能的损伤(P<0.05)。5)与ST组相比,饲粮中添加不同浓度的HNa显著降低了肉鸡肝组织白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-18、一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞分化抗原68(CD68)的mRNA表达,显著增加了IL-10、精氨酸酶-1(ARG1)和CD163的mRNA表达(P<0.05)。6)与CON组相比,S. Typhimurium感染显著提高了肉鸡肝组织核因子κB(NF-κB p65)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和半胱天冬蛋白酶-1(Caspase-1)的蛋白表达,降低了核因子κB抑制蛋白α(IκBα)的蛋白表达(P<0.05);饲粮中添加HNa抑制了S. Typhimurium感染引起的肉鸡肝组织NF-κB和NLRP3信号通路的激活。综上所述,饲粮中添加HNa可以通过降低肝组织炎症反应、提高肝抗氧化功能、抑制肝NF-κB和NLRP3信号通路的激活缓解S. Typhimurium感染引起的肉鸡肝损伤。

旨在为表达牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的纤突蛋白(S蛋白),并评价其作为免疫原免疫小鼠后的免疫效果。本研究以BCoV/SWUN/HXD-4/2021株的全长S基因为模板,针对昆虫细胞进行密码子优化和合成,构建重组质粒pFastBac-Dual-S,与DH10Bac同源重组后转染昆虫细胞收获重组杆状病毒rpFastBac-S,利用基因组PCR、免疫印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验对其进行鉴定,测定杆状病毒滴度。优化和筛选感染剂量对蛋白表达的影响,超速离心纯化蛋白,免疫小鼠和评估其免疫效果。结果显示:优化后全长4 108 bp的BCoV S基因CAI(密码子适应指数)从0.39调整为0.87,平均GC含量从35.8%调整为50.6%。经双酶切、PCR验证,重组质粒与重组杆粒均构建成功。用5 μg重组杆粒Bacmid-S转染Sf9细胞并传代至第四代后细胞病变趋于稳定,感染杆状病毒约20 h后产生典型病变,收获重组杆状病毒进行鉴定。PCR电泳结果显示重组杆粒携带S目的蛋白基因;间接免疫荧光试验显示,试验组观察到特异性绿色荧光;Western blot结果显示重组杆状病毒rpFastBac-S所表达的蛋白为S目的蛋白,目的条带位于250 ku左右,感染剂量MOI=0.5时蛋白表达量最高。将50 μg蛋白、20 μg CpG免疫增强剂与等体积MF59佐剂充分混合乳化后,肌肉注射免疫小鼠,间接ELISA试验结果显示,小鼠免疫蛋白后产生了IgG特异性抗体,且抗体水平高于佐剂对照组(P<0.001),最高抗体效价达1∶12 800;微量中和试验结果显示,小鼠血清中和效价最高达1∶224,试验组中和效价平均值高于灭活病毒组,但统计学差异不显著(P>0.05)。本研究利用杆状病毒表达系统表达了牛冠状病毒S蛋白,并对S蛋白免疫保护效果做了进一步评价,为后续牛冠状病毒疫苗研究提供了理论依据。

牛病毒性腹泻病原严重危害畜牧业生产,BVDV、BoAstV、BCoV、MRV、BKoV、BoNeV、BNoV、BRV、BToV被认为是引起牛群腹泻的病原,不仅如此,BVDV、BCoV和BToV除了能引起消化道症状外还能引起呼吸道症状,BVDV不仅能引起消化道和呼吸道症状,还会导致母牛生殖功能异常,这些疾病对畜牧业造成巨大的经济损失。为了解牛主要病毒性腹泻病原流行情况,本次试验通过PCR检测方法对我国河北地区323份腹泻牛粪样品进行常见9种病毒性牛腹泻病原进行检测。结果显示,BVDV阳性检出率1.85% (6/323)、 BCoV阳性检出率14.24% (46/323)、BRV阳性检出率57.89% (187/323)、BoAstV阳性检出率0.31% (1/323)、BoNeV阳性检出率10.84% (35/323)、BNoV阳性检出率4.33%(14/323)、MRV阳性检出率2.48% (8/323)、BToV阳性检出率4.64% (15/323)、BKoV阳性检出率11.76% (38/323)。混合感染共有76份,占比23.53%(76/323)。HBLF2302株的全基因序列、S、HE、N、M和E基因进行同源性和遗传进化分析发现,HBLF2302与BCoV/NMG1/2022基因同源性最高,为GIIb亚型。基于氨基酸序列比对和HBLF2302的S蛋白三级结构预测发现,在S蛋白中157号位突变为157T,854号位点突变为854I。318V为独特突变,改变了与侧链残基的作用力,与631C形成氢键连接。并发现中国株区别于其它地区的GⅡb亚型,位于ORF1a区域有三个独特位点。本研究丰富了牛腹泻病原的流行病学数据,为牛腹泻病的防控奠定基础。

物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A, ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A, caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及犬肺、脾、肠不同组织中扩增和克隆caANP32A;激光共聚焦试验分析caANP32A与A型流感病毒RNA聚合酶的相互作用;双荧光素酶报告基因试验检测过表达caANP32A对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响。结果显示,从MDCK细胞中扩增到新的caANP32A,比已报道的caANP32A多出4个氨基酸插入,从犬肺、脾和肠组织中均扩增到该新的caANP32A;对caANP32A的基因进行测序分析,发现该新的caANP32A不是由mRNA选择性剪接形成的;激光共聚焦试验发现,新caANP32A与H3N2 CIV的RNA聚合酶在细胞核中共定位;聚合酶活性试验显示,在哺乳动物细胞过表达新caANP32A不能促进H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和H3N2犬流感病毒(canine influenza virus, CIV)的RNA聚合酶活性,而鸡ANP32A(chANP32A)能够促进。本研究克隆的新caANP32A较以往报道,在176至179位存在四个氨基酸LSLV的插入,但新caANP32A对AIV的RNA聚合酶活性仍然有物种限制性且该新的caANP32A也未增强CIV的RNA聚合酶活性。本研究为进一步解析犬在流感病毒跨物种感染中的作用提供依据。

本文旨在构建脂磷壁酸合成酶ltaS基因缺失株,探讨ltaS基因对产单核细胞李氏杆菌致病力的影响。本研究利用同源重组技术构建产单核细胞李氏杆菌ltaS基因缺失株,通过生物学特性试验探究ltaS基因缺失株对产单核细胞李氏杆菌生长能力和菌体形态的影响,Western blot试验探究亲本株EGDe-prfA^*、缺失株ΔltaS对InlA和InlB在细菌表面的锚定情况;使用鸡胚成纤维DF-1细胞进行细胞黏附侵袭试验、小鼠RAW264.7细胞进行吞噬试验与巨噬细胞内增殖试验测定ltaS基因对产单核细胞李氏杆菌侵染能力的影响;小鼠脏器细菌载量和小鼠存活试验评估ltaS基因缺失对产单核细胞李氏杆菌致病性的影响。结果显示:利用同源重组技术成功构建产单核细胞李氏杆菌ltaS基因缺失株,生长曲线试验和光学显微镜观察发现ltaS基因不影响产单核细胞李氏杆菌在BHI中正常生长和细菌形态,通过Western blot试验验证ltaS基因缺失导致细菌表面毒力的InlA和InlB锚定量降低。细胞黏附侵袭试验结果表明,ΔltaS对DF-1的黏附率极显著低于亲本株EGDe-prfA*(P<0.01)并且侵袭率也极显著低于亲本株EGDe-prfA*(P<0.01);吞噬试验结果显示,小鼠巨噬细胞RAW264.7对ΔltaS的吞噬率与亲本株EGDe-prfA*相比无显著性差异(P>0.05);而在增殖试验中,ΔltaS在RAW264.7中增殖量与亲本株EGDe-prfA*存在显著差异(P<0.05)。小鼠致病力试验结果显示,经ΔltaS感染的小鼠的肝、脾内细菌载量均显著低于EGDe-prfA*(P<0.01)并且EGDe-prfA*感染后的小鼠96 h内全部死亡,而缺失株ΔltaS感染的小鼠存活率为80%,测定出亲本株EGDe-prfA*半数致死量LD₅₀为1.7×10⁴ CFU,缺失株ΔltaS半数致死量LD₅₀为7.49×10⁶ CFU。综上所述,ltaS基因缺失显著减少表面InlA和InlB的锚定量,减弱产单核细胞李氏杆菌对DF-1细胞的黏附侵袭能力与RAW264.7内细菌增殖能力,并且降低对小鼠的致病性。

为明确重庆和贵州部分羊场发生体表淋巴结脓肿病料中伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp) 感染情况及其生物学特征,对山羊体表脓肿样本进行Cp分离鉴定、致病性试验、药敏试验、毒力/耐药基因检测及系统进化分析。结果:从40份样本中分离到23株Cp,分离率达57.5%。毒力基因检测显示,所有Cp分离菌均携带pld、FagA、FagB、OppB、OppD、OppF、SodC、SpaC、pknG、NanH、sigE和cp40基因。药敏试验显示,所分离Cp对头孢拉定、丁胺卡那和多西环素敏感率最高,达95.65%(22/23),其次为青霉素、氨苄西林、四环素、万古霉素和环丙沙星,敏感率为91.30%(21/23),但对呋喃唑酮100%耐药,对新霉素和卡那霉素耐药率为82.61%(19/23)。Cp分离菌中氨基糖苷类耐药基因aph(3')-IIa和广谱A类β内酰胺酶耐药基因bla_TEM-116的检出率分别为0和4.35%。对所有Cp的fusA进行测序并获得GenBank登录号ON969140-ON969162,系统进化分析显示所分离的Cp均聚类到羊生物型(biotype ovis)。本研究证实Cp是引起重庆和贵州部分羊场发生体表淋巴结脓肿的主要病原,并明确其部分生物学特性,为防控该病原提供了参考资料。

旨在获得褐黄血蜱重组蛋白(rHfFer1和rHfAV422)并评价其作为抗蜱疫苗的免疫保护效果。通过原核表达获得rHfFer1和rHfAV422,然后将22只新西兰兔随机分为3组(皂素对照组和两个免疫组),其中皂素对照组6只,两个免疫组各8只,所有兔均免疫两次,首免14 d后同等剂量进行二免,二免后一周感染幼蜱,根据蜱的饱血率和蜕皮率为指标评估抗蜱效果。结果显示,rHfFer1和rHfAV422免疫组的饱血率和蜕皮率与对照组均存在显著差异(P<0.05),计算得出rHfFer1和rHfAV422的抗蜱效果分别为68.06%和50.00%。研究结果表明,rHfFer1和rHfAV422可以作为抗蜱疫苗研发的候选抗原。

本研究旨在突变猪瘟病毒C株WH303位点,构建感染性克隆,为猪瘟病毒C株标记疫苗的研究提供候选毒株。本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经重叠PCR方法突变WH303位点,再分别连接至C株和C-flag株全长感染性克隆。体外转录RNA,转染PK15细胞,细胞连续传代完成病毒的拯救和增殖。结果显示,经特异性限制内切酶酶切反应验证,感染性克隆构建成功。经RT-PCR、过氧化物酶单层细胞试验检测,表明病毒成功拯救。病毒细胞传代至17代,检测到病毒,表明病毒可以稳定传代。综上,本研究成功构建了C株WH303突变感染性克隆MC和MC-flag,并成功拯救MC株,得到可以稳定传代的病毒株。

旨在系统评价和分析我国2012—2022年羊群中蓝舌病毒(bluetongue virus,BTV)感染状况,为我国羊群BTV防控提供理论依据。通过检索2012—2022年中国知网(CNKI)、万方、维普、PubMed和ScienceDirect 5个数据库中对中国羊群BTV流行情况研究的文献并进行Meta分析。检索并筛选后共纳入Meta分析的有28篇文献,涉及样本总数为38 226头羊,其中9 109头羊为BTV阳性。分析显示,我国羊群中BTV的整体流行率为23.8%(95%CI: 23.4, 24.3),其中绵羊流行率为29.4%(95%CI: 14.7, 44.1),山羊流行率为25.1%(95%CI:18.6, 31.7)。我国各省/市间比较发现,重庆市流行率最高,为34.6%(95%CI: 32.0, 37.1),其次为云南省和内蒙古自治区。亚组分析发现,我国5大区域BTV流行率存在显著地区差异(P=0.011),中国东部、南部、西部、北部及中部地区流行率分别为6.1%(95%CI: 4.3, 7.9)、33.8%(95%CI: 29.5, 38.1)、21.7%(95%CI: 17.1, 26.2)、21.0% (95%CI: 8.3, 33.6)及26.6%(95%CI: 24.3, 28.8)。同时,检测方式和气候类型也是我国羊群中BTV流行的风险因子(P<0.05)。上述分析结果提示,我国羊群中BTV流行率较高并且分布广泛,有必要持续对我国BTV的感染状况进行监测并采取适当的预防措施。

国内鲜有马乳源PVL⁺ST22型金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)相关报道,本研究对1株新疆马乳源PVL⁺ST22型金黄色葡萄球菌的致病性进行评估,以期为马乳源金黄色葡萄球菌的相关研究提供基础数据。使用选择性培养基从新疆健康马乳中分离金黄色葡萄球菌,然后通过生化鉴定和分子鉴定方法对金黄色葡萄球菌进行鉴定。对所获得的金黄色葡萄球菌进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、spa分型、药物敏感性检测、生物被膜形成能力、溶血活性、毒力基因检测、小鼠皮肤脓肿和致病性试验。再对分离株进行小鼠细胞的黏附、侵袭和胞内增殖试验,以评估其致病性。结果显示,从马乳中分离得到1株PVL⁺ST22型金黄色葡萄球菌(1/65,1.5%),spa分型为t304。仅对青霉素耐药,无生物被膜形成能力,但携带9种毒力基因(sec、seg、seh、tsst-1、hla、hlb、clfA、clfB和cna),并且具有溶血活性。小鼠皮肤脓肿和致病性试验表明,其可导致小鼠形成皮肤脓肿,并且在高剂量感染时可导致小鼠死亡。ST22型金黄色葡萄球菌可在小鼠巨噬细胞中黏附(4.26%)、侵袭(6.45%)和胞内增殖,并可造成细胞凋亡。综上,马乳源PVL⁺ST22型金黄色葡萄球菌具有较强的致病力,可能在宿主致病和公共卫生安全等方面存在隐患。

旨在为解决耐药铜绿假单胞菌感染提供不同方法。以鸡源铜绿假单胞菌为宿主菌,从医院污水中分离纯化出铜绿假单胞菌噬菌体,并进行生物学特性研究与基因组学分析,同时采用棋盘法与三种抗生素联合应用测试其效果。结果显示:从医院污水中分离到一株铜绿假单胞菌噬菌体PaVOB,TEM显示病毒颗粒具有一个平均直径为73.02 nm的二十面体头部和一个平均长度为155.57 nm的长尾部,属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科,具有双链DNA基因组,宿主谱较窄,耐低温(-20 ℃)并且在37 ℃达到最适温度,有良好的酸碱耐受性,在pH为3~12时保持活性,最佳MOI为0.001,一步生长曲线显示潜伏期为10 min,爆发量为50 PFU·cell^-1,吸附性试验表明PaVOB在10 min的吸附率为99.1%。PaVOB基因组全长为72 179 bp,(G+C)%含量为54.81%,与VB PaeP FBPa1亲缘关系小于0.1,ORF预测显示,PaVOB包括74个ORF,软件预测均未发现毒力基因、耐药基因和tRNA存在。此外,抗生素联合应用结果显示,PaVOB与头孢曲松联合应用有协同作用,在效价为10⁷ PFU·mL^-1时与恩诺沙星产生协同作用,与庆大霉素产生无关作用。铜绿假单胞菌噬菌体PaVOB对环境适应能力强,且基因组信息清晰,能够选择性地与不同抗生素联合应用发挥协同作用,具有治疗临床耐药铜绿假单胞菌感染的可能性。

本研究旨在筛选黑茶中有益的冠突散囊菌(Eurotium cristatum,EC)并揭示该菌上清抑制鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium)的初步机制。采用稀释涂布法分离冠突散囊菌;通过形态学和 ITS rRNA 基因序列分析其分类地位;采用生长速率法分析其增殖条件及增殖的稳定性;采用琼脂扩散抑菌试验、耐酸碱、耐热及紫外光稳定性试验、电镜观察及小鼠动物试验等以评估该Ec-12上清抑制鼠伤寒沙门菌的初步机制。结果显示:筛选到一株有较强抑制鼠伤寒沙门菌作用的冠突散囊菌Ec-12,抑菌圈分别为10.4 mm±1.5 mm。根据形态学、生长特征及 ITS rRNA基因序列分析,将其鉴定为冠突散囊菌,并命名菌株Ec-12。粗分离的菌株Ec-12上清在 pH 近中性条件产生较好的抑菌效果,抑菌稳定好。经电镜观察可见粗分离菌株Ec-12上清导致鼠伤寒沙门菌的菌体变形,表层粗糙等抑菌现象。并明显降低小鼠感染鼠伤寒沙门菌引起的腹泻率和死亡率,提高小鼠绒毛的完整度和增加黏液蛋白的分泌(P<0.05),减少结肠细胞的凋亡(P<0.05),抑制鼠伤寒沙门菌对小鼠的危害。冠突散囊菌Ec-12菌株上清作用于鼠胃肠道内的鼠伤寒沙门菌,破坏了鼠伤寒沙门菌结构完整性,同时又作用于鼠的肠道,提高肠绒毛完整性,促进结肠黏液蛋白的分泌,减少结肠细胞的凋亡,进而降低鼠伤寒沙门菌引起的腹泻及死亡,它具备一定益生的潜力。

在现代生猪规模化养殖过程中,无论是断奶、换舍和换料等因素引起的应激反应还是细菌、病毒感染都极易影响消化道健康引起以腹泻为主要症状的肠道炎症。本文通过研究临床腹泻猪空肠组织中肾素-血管紧张素系统(renin-angiobensin system, RAS)的表达变化,探讨其与肠道炎症的关系。以临床上出现腹泻症状的保育猪为研究对象,截取其空肠组织,采用组织病理学、Western blot和RT-qPCR等方法,观察其空肠组织病理变化,明确RAS组分特别是血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)的表达变化,探究其对猪肠道炎症损伤的影响。结果表明,临床腹泻保育猪的空肠组织中促炎性因子TNF-α、IL-1β显著升高,抗炎性因子IL-10无明显变化;组织病理学显示,空肠上皮绒毛脱落,腺体增生,存在大量出血点;ACE2、MasR mRNA和蛋白水平及Ang(1-7)含量均降低,ACE和AT1R蛋白水平及Ang II含量均升高。结果提示,临床腹泻保育猪空肠组织局部RAS被激活,ACE-Ang II-AT1R轴的活性远高于ACE2-Ang(1-7)-MasR轴,ACE2抗炎性损伤作用处于劣势。

本研究旨在通过高分辨率熔解曲线(high-resolution melting, HRM)方法检测马立克病(Marek's disease,MD)肿瘤中存在的微卫星不稳定现象(microsatellite instability, MSI)。通过临床症状、病理剖检、组织病理学、PCR及测序确定为马立克病。采集5只发病鸡的肌肉、肝、脾、血液及肿瘤组织,提取DNA,采用15对扩增微卫星DNA序列的引物进行HRM检测,得到归一化处理的差异熔解曲线,比较分析各组织熔解曲线的差异,分析15个微卫星标记是否存在基因突变(即MSI)。结果表明,发病鸡的各种临床、病理表现符合为马立克病的特征,病毒meq基因序列与近年来国内流行的MDV强毒株有较高的同源性。HRM分析结果显示,MD发病鸡的肌肉、肝、脾、血液、肿瘤组织中微卫星标记PCR扩增后的熔解曲线存在明显的差异,即存在MSI现象,而且不同的病鸡个体和不同的微卫星标记发生MSI的频率不同。15个微卫星标记在5只鸡的病料中存在MSI的微卫星标记的个数分别为14、7、5、3和1。在15个微卫星标记中,MCWO200、MCW0220这两个微卫星标记在所有的病鸡中都存在MSI,而ADL0158微卫星标记在所有的病鸡中都不存在MSI。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序分析进一步证明这些微卫星PCR扩增片段确实存在片段大小不同,碱基序列中存在微卫星重复单位的增多、减少或基因片段的插入或缺失。结果提示,通过HRM分析可以检测MD肿瘤中的MSI现象,是一种灵敏、准确、简便、高通量的方法。

本研究分别将Fc片段、穿膜肽R11和穿膜肽TAT与犬成纤维生长因子21(canine fibroblast growth factor 21,cFGF-21)相连构建了3种融合蛋白,旨在探讨cFGF-21对1型糖尿病的长效降糖作用。用链脲佐菌素(STZ)建立1型糖尿病小鼠模型,随后分别用cFGF-21、R11-cFGF-21、Fc-cFGF-21和TAT-cFGF-21治疗。治疗分为3个阶段:1)每天给药一次(第1~14天);2)每3 d给药一次(第15~29天);3)每5 d给药一次(第30~44天)。在治疗过程中,每隔3 d检测一次小鼠血糖,在每阶段结束时检测试验小鼠12 h内血糖波动。试验结束前,对所有小鼠进行口服葡萄糖耐量试验。通过ELISA法检测小鼠血清中炎症相关因子IL-10、IL-1β、IL-17A和抗炎因子IL-10表达水平。通过Real-time PCR检测肝、脂肪、肠和肾等组织中的糖代谢相关因子的转录水平。试验结束后,对所有小鼠进行糖基化血红蛋白(HbA1c)、血脂四项和肝功能、血清胰岛素和HbA1c检测并对小鼠胰腺组织进行病理分析。结果显示:在治疗的第一阶段,与cFGF-21组相比,TAT-cFGF-21降糖效果明显降低,R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21组没有显著差异;在治疗的第二、三阶段,与cFGF-21组相比,TAT-cFGF-21组血糖明显上升,R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21组可在给药3~5 d内能将血糖控制在更低的水平。治疗8周后,与cFGF-21组相比,R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21组口服葡萄糖耐量 (OGTT) 和血脂紊乱明显改善,糖化血红蛋白 (HbA1c) 接近正常水平,肝损伤明显修复,而TAT-cFGF-21组与cFGF-21组没有明显差距。此外,ELISA检测和HE染色结果显示,相较cFGF-21和TAT-cFGF-21组,R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21组氧化应激和炎症反应得到显著改善且胰岛β细胞修复效果明显。经R11和Fc修饰的cFGF-21长效降糖能力的显著增加,而TAT-cFGF-21长期的降血糖能力较弱。此外,经R11和Fc修饰的cFGF21能显著改善氧化应激、胰腺炎症和脂质代谢,修复肝损伤和胰岛β细胞,治疗效果明显优于cFGF21。

鸽毛滴虫病是一种极易传播的寄生虫病,严重影响鸽的生产性能,甚至导致鸽的死亡,给养鸽业带来巨大经济损失。然而,临床上防控鸽毛滴虫病的药物多为化药,药物使用周期较短,毒副作用大。为更好地开发临床天然抗寄生虫用药,本文研究了中药龙胆草抗鸽毛滴虫的临床药效,为养鸽业鸽毛滴虫病的治疗提供新的用药策略。通过对鸽毛滴虫的分离、鉴定、纯化,获得稳定用于后续试验的虫株,在体外测定龙胆草水提物对鸽毛滴虫的相对生长抑制率和最低有效浓度;为进一步观察药效,作者将不同剂量浓度的龙胆草水提物加入基础日粮中,在体内测定龙胆草水提物对患病肉鸽体重、存活率、鸽毛滴虫活性、血液生化指标及炎症因子含量的影响,以此来评价中药龙胆草体内外抗鸽毛滴虫的临床药效。体外试验结果表明,龙胆草水提物作用12 h杀灭全部虫体的最低有效浓度(MEC)为50 mg·mL^-1,具有较强的体外抗鸽毛滴虫活性;体内试验结果表明,龙胆草水提物对体重降低的病鸽有恢复体重的作用并能够提高患鸽生存率;龙胆草水提物杀虫效果与对照组相比效果显著(P＜0.05),与甲硝唑组无显著差异(P>0.05),且龙胆草500 mg ·只^-1组药效持续时间长于甲硝唑组;血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、ALT/AST含量低于对照组;血清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、转化生长因子-β(TGF-β)3种炎症因子含量高于对照组,与甲硝唑组相似。龙胆草水提物对治疗鸽毛滴虫病具有显著的临床药效,其药效作用达到了化药甲硝唑的疗效,且无显著的毒副作用,因此,龙胆草可以用作抗鸽毛滴虫病潜在的天然药物开发。

本研究旨在探讨香砂六君子汤对产肠毒素大肠杆菌(entexotoxigenic Escherichia coli, ETEC)诱导的断奶仔猪腹泻的干预作用及其机制。将24头21日龄断奶仔猪随机分为空白组(CON)、模型组(MOD)和香砂六君子汤组(XS),连续14 d给XS组灌服香砂六君子汤(1 mL·kg^-1,1 g·mL^-1),其余组灌服等量无菌水,第15天给MOD组、XS组仔猪按1 mL·kg^-1连续3 d灌服10¹¹ CFU·mL^-1 ETEC菌液,XS组继续灌服香砂六君子汤。分别记录各组仔猪腹泻评分,HE法检测回肠组织病理学变化,实时荧光定量PCR检测回肠组织IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA水平,转录组学分析回肠组织RNA差异表达情况,微生物宏基因组学分析回肠菌群变化情况,Western blot检测回肠组织p-p38/p38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK蛋白水平。结果表明,灌服ETEC后,MOD组腹泻评分极显著高于CON组(P＜0.01),回肠组织结构破坏,V/C值极显著下降(P＜0.01),且IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表达量极显著升高(P＜0.01),肠道菌群门水平上变形菌门极显著上调(P＜0.01),厚壁菌门极显著下调(P＜0.01),属水平上乳酸菌属下调,志贺菌属上调,回肠组织p-p38/p38和p-JNK/JNK比值显著或极显著升高(P＜0.05或P＜0.01)。与MOD组相比,XS组腹泻评分极显著下降(P＜0.01),回肠组织结构完整,V/C值极显著升高(P＜0.01),回肠组织IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表达量显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01),肠道菌群门水平上变形菌门极显著下调(P＜0.01),厚壁菌门极显著上调(P＜0.01),属水平上乳酸菌属上调,志贺菌属下调,回肠组织p-p38/p38和p-ERK/ERK比值极显著降低(P＜0.01)。肠道组织基因转录组学筛选出与炎症免疫相关的差异显著的10个基因,分别为TNFAIP8L2、TRIM67、CXCL2、EGF、NOX1、CCL28、FABP2、FABP6、IL1RAP和CEBPB。微生物组学筛选出各组可能的标志物种分别为CON组的Lactobacillaceae,MOD组的Shigella,XS组的Deinococcus和Eubacterium。综上所述,香砂六君子汤可有效缓解ETEC诱导的断奶仔猪腹泻,提高肠道菌群中有益菌的丰度,逆转ETEC诱发的菌群结构的改变,并可通过抑制MAPK信号通路的激活,从而缓解ETEC诱导的肠道炎性损伤。

旨在探讨积雪草酸(AA)对脂多糖(LPS)诱导肉鸡肾细胞凋亡和自噬的影响。将40只1日龄肉鸡适应性饲养至7日龄,并随机分为对照组(Con)、LPS组(LPS)、低剂量AA组(LPS+AA 15 mg·kg^-1)和高剂量AA组(LPS+AA 30 mg·kg^-1)。AA预处理组的肉鸡连续14 d每日灌胃相应剂量AA。除Con组,其余组肉鸡在第16、18和20日龄时腹腔注射0.5 mg·kg^-1 剂量的LPS构建急性肾损伤(AKI)模型;第21日龄时处死肉鸡并采集肾组织样品。苏木精-伊红(HE)染色观察肾组织病理学变化;计算肾脏系数和检测肾组织抗氧化酶水平;实时荧光定量(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)分别检测凋亡和自噬相关基因及蛋白的表达;免疫组织化学和免疫荧光检测细胞色素c(Cytc)和微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)蛋白在肾组织的表达与分布;TUNEL染色检测肾细胞凋亡率。结果发现,AA可减轻LPS诱导的肉鸡肾病理损伤,显著降低肾脏系数和肾组织丙二醛(MDA)含量,显著升高谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性(P<0.05)。AA显著降低了LPS诱导的AKI中P53、BAX和Caspase3的mRNA表达,显著促进了LPS诱导的AKI中BCl2、Beclin1、ATG5、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的mRNA表达(P<0.05);此外,AA预处理显著降低了LPS诱导的AKI中P53、Bak1、BAX和Cleaved-Caspase3的蛋白表达(P<0.05),显著促进了LPS诱导的AKI中Beclin1、ATG5、LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达(P<0.05)。免疫组织化学和免疫荧光结果表明,AA预处理显著降低了LPS诱导的AKI中Cytc蛋白的表达与分布(P<0.001),促进了LC3蛋白在LPS诱导的AKI中的表达与分布(P<0.001)。TUNEL结果表明,AA显著降低了LPS诱导的肉鸡肾细胞凋亡率(P<0.001)。总之,AA通过抑制氧化应激、促进细胞自噬和降低细胞凋亡,缓解了LPS诱导的肉鸡AKI。此结果为AA成为潜在饲料添加剂和预防LPS诱导肉鸡AKI提供了理论依据。

旨在探究大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)感染奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺组织致其线粒体损伤的机制。本试验以奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺为研究对象,按试验要求分别随机分成3组:空白对照(Control)组、大肠杆菌(E.coli)组和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组。Control组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺未被E.coli感染;E.coli组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺被感染复数为5或10⁶ CFU的E.coli感染6或24 h,LPS组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺经1 μg·mL^-1或20 mg·kg^-1体重LPS处理6或24 h,奶牛乳腺上皮细胞每组3个重复,小鼠乳腺每组6只小鼠。结果表明:1)奶牛乳腺上皮细胞胞浆中角18蛋白被染成绿色且均匀分布在细胞浆内,细胞核被DAPI染成蓝色。2)正常培养的奶牛乳腺上皮细胞内线粒体结构完整,细胞连接紧密;经E.coli感染的奶牛乳腺上皮细胞细胞间隙增大,线粒体肿胀,线粒体嵴缺失且部分模糊消失。3)E.coli感染或LPS处理使小鼠乳腺腺泡内出现中性粒细胞,且使奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺线粒体能量代谢(D(520 nm)吸光值、ATP的含量、线粒体电子传递链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性降低)、线粒体的融合与分裂(Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2和OPA1 mRNA表达减少)和线粒体的生物发生(PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表达下降)极显著降低(P<0.05,P<0.01)。上述研究表明,E.coli感染主要通过LPS造成奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺线粒体能量代谢紊乱、抑制线粒体分裂与融合以及减少线粒体的生物发生,进而造成线粒体损伤,最终导致乳腺炎的发生。因此,确认E.coli感染是通过诱导线粒体损伤造成奶牛乳腺炎,且线粒体损伤可能是造成乳腺损伤的重要原因之一。

旨在通过网络药理学和动物试验探究白术-肉苁蓉治疗便秘的效果和机制。通过TCMSP数据库获得白术-肉苁蓉成分及对应的靶点蛋白,借助GeneCards、OMIM等数据库得到便秘相关靶点。将基因整理导入UniProt数据库后利用Venny2.1.0、Cytoscape3.7.2和STRING绘制韦恩图及蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,并使用CentiScaPe 2.2插件进行分析。再通过DAVID数据库进行生物信息学GO分析及KEGG信号通路富集分析。通过AutodockTools和PyMOL等软件对部分核心靶点与潜在靶点较多的成分进行分子对接验证。将40只小鼠随机分为空白组(6只)和盐酸洛哌丁胺组(34只),分别用蒸馏水和10.0 mg·kg^-1盐酸洛哌丁胺灌胃。造模成功后,将30只便秘小鼠均分为模型组、阳性对照组和高、中、低剂量药物组。空白组和模型组蒸馏水灌胃,阳性对照组10.0 mg·kg^-1枸橼酸莫沙必利灌胃,高、中、低剂量药物组分别灌胃4.8、2.4、1.2 g·kg^-1的白术-肉苁蓉混悬液治疗,每日1次,持续7 d。7 d后进行排便和小肠运动试验。结果发现,PTGS2为连接度最高的靶点基因,共筛选出AKT1、TNF和IL-6等19个白术-肉苁蓉治疗便秘的核心靶点,KEGG富集分析表明,脂质和动脉粥样硬化及乙型肝炎等通路较为关键。分子对接结果显示,白术-肉苁蓉潜在靶点较多的成分与便秘核心靶点结合较好。动物试验表明,与模型组比较,中、高剂量药物组首粒黑便时间显著缩短,小肠推进率显著增高。综上,白术-肉苁蓉可改善慢传输型便秘,多种活性成分可能通过PTGS2、AKT1、TNF和IL-6等关键靶点,调节多条信号通路治疗便秘。

旨在研究毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX的反应原性及其在虫体内的亚细胞定位。提取毒害艾美耳球虫(扬州株)配子体总RNA,RT-PCR扩增EnGPX的ORF编码序列,构建原核表达质粒pET-28a(+)-EnGPX,转化至BL21(DE3)进行体外诱导表达,同时制备鼠抗rEnGPX多克隆抗体,对重组蛋白进行Western blot反应原性分析和激光共聚焦免疫荧光定位分析。结果表明,EnGPX ORF序列全长753 bp,编码250个氨基酸,体外重组表达蛋白大小约30 ku,主要以包涵体形式存在。该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体,鼠抗rEnGPX多克隆抗体,毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清所识别,表明其具有较好的反应原性和交叉反应原性。在天然配子体蛋白中检测出EnGPX,其编码蛋白主要分布于配子体内的Ⅱ型成壁体(WFBII)及卵囊壁上。本研究成功克隆表达了毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX,验证其具有良好的反应原性,并定位于配子体及卵囊壁上。以期为研究EnGPX参与卵囊壁形成的分子机制提供新的线索,也为研制新型球虫亚单位疫苗提供新的靶标。

旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus ,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD₅₀)、实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)、蛋白质印迹(Western blot)和荧光观察分析D1133L单克隆抗体对病毒复制的影响。结果显示:不同浓度的单克隆抗体在不同的感染时间对ASFV的病毒效价(P<0.01),蛋白表达水平,基因转录水平(P<0.01),ASFV-GFP绿色荧光蛋白的表达水平(P<0.05)均有显著抑制, 且这种抑制作用具有剂量依赖性。综上所述,D1133L单克隆抗体可显著抑制 ASFV 的复制,试验结果在ASFV药物靶点的选择上具有一定的参考意义。

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^-1;重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。