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当期目录

2014年 第45卷 第4期 刊出日期:2014-04-23
综述
卵巢miRNA研究进展
徐源,孙铁成,张爱玲,李加琪
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  509-516.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.001
摘要 ( 278 )   HTML( )    PDF (419KB) ( 852 )  
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卵巢是雌性动物最重要的生殖器官,了解卵巢卵泡发育、激素分泌的分子调控机制,对于畜牧生产以及人类卵巢疾病的诊断和治疗具有重大意义。miRNA是一类长度约22 nt、在物种间广泛分布并高度保守的非编码小分子RNA,其作用形式包括介导靶mRNA降解或翻译抑制。众多研究表明,miRNA参与了卵子发生,卵泡发育、闭锁和黄体形成、退化等多个生物学过程,对卵巢miRNA的研究有助于从转录后水平揭示调控卵巢功能的分子机制。本文综述了近年来卵巢miRNA的研究进展,特别关注了卵泡发育和卵巢疾病相关miRNA的研究。

Hsp70对胃肠道黏膜的保护及其免疫调控作用
钟翔,王恬
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  517-523.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.002
摘要 ( 272 )   HTML( )    PDF (744KB) ( 987 )  
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热应激蛋白70 (Hsp70)作为分子伴侣,对胃肠道黏膜细胞的保护及其免疫调控具有重要作用,然而,其作用机理尚未完全清楚。本文综述了Hsp70在胃肠道中的表达与定位,阐述其对胃肠道黏膜的保护功能,特别是Hsp70介导免疫调控的分子生物学机理。

遗传繁育
荣昌猪杂交群体基因组拷贝数变异鉴定与分析
龙熙,邱小田,陈磊,王金勇,李学伟
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  524-532.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.003
摘要 ( 304 )   HTML( )    PDF (1471KB) ( 720 )  
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为找出可能的性状相关遗传标记,本研究利用猪SNP60芯片对150头荣昌猪杂交群体基因组拷贝数变异区域(CNV regions,CNVRs)进行检测。结果,发现5个CNVRs,其中缺失CNVRs 3个 (CNVRs 2,4,5),重复CNVRs 2个(CNVRs 1,3),分别位于1、7、8、13、14号染色体上。其中CNVR1和CNVR5为新发现的CNVRs,CNVR2和CNVR3为已有报道但还未验证过的区域。采用qPCR方法对CNVRs进行拷贝数变异验证,发现CNVR2、CNVR3和CNVR5在多个猪种中都具有丰富多态性;而CNVR4为芯片假阳性结果。在qPCR验证的3个CNVRs中有46个蛋白编码基因,这些基因主要富集在嗅觉受体活性、乙醇代谢、神经系统发育以及脂肪酸代谢通路中。本研究结果为解析品种间表型变异的遗传基础提供了新的遗传变异素材。

徐淮山羊c-Myc基因启动子的克隆及其功能的初步分析
韦光辉,左其生,李东,张亚妮,刘志永,朱睿,邱峰龙,李碧春
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  533-540.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.004
摘要 ( 280 )   HTML( )    PDF (1511KB) ( 801 )  
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本研究旨在确定徐淮山羊c-Myc基因启动子区域,找出该基因启动子的核心调控区,初步探讨c-Myc基因的表达调控机制。根据UCSC基因组数据库已公布的绵羊c-Myc基因的启动子序列,设计特异性PCR引物扩增c-Myc基因的一系列启动子缺失片段,定向克隆至pEGFP-N1和PGL3-c-Myc,分别转染gFF、COS7及P19细胞,并进行TSA和NFAT1诱导,同时对-402~-249 bp区域的转录因子SP1结合位点进行定点突变,最后进行双荧光报告基因活性检测。结果表明,徐淮山羊c-Myc基因5′侧翼区-1 334~+1 bp区域的启动子活性最强,-402~+1 bp区域为c-Myc基因启动子基本活性区域。进一步研究发现,-1 334~-971 bp、-587~-147 bp区域存在正调控元件,-1 976~ -1 334 bp、-971~-587 bp区域存在负调控元件。TSA和NFAT1均能增强c-Myc启动子的活性,SP1结合位点定点突变后,启动子活性降低。本试验通过构建包含c-Myc基因启动子不同片段的重组报告基因载体并比较其转录活性,确定了c-Myc基因启动子的核心区域,发现转录因子SP1是c-Myc基因启动子核心区域的调控元件,为进一步研究c-Myc基因的表达调控机制奠定了基础。

中国美利奴绵羊磷脂酶C zeta基因真核表达载体的构建及其表达研究
刘强,贺志锐,王银龙,乌热力哈孜,赛务加甫
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  541-546.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.005
摘要 ( 240 )   HTML( )    PDF (2629KB) ( 710 )  
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旨在构建PLCζ真核表达载体,初步研究其在体细胞系中的表达特性。本研究用PCR技术扩增出PLCζ基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建了重组质粒pEGFP-N1-PLCζ转染293T细胞和绵羊成纤维细胞,在倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察重组质粒在细胞中的表达和分布。经酶切与测序证明,本试验成功的构建了pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体,并且成功与绿色荧光蛋白融合表达。本试验实现了pEGFP-N1-PLCζ在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达,这将有利于进一步通过核移植来研究其重组蛋白对卵母细胞的激活作用。

WY14643对小鼠早期胚胎抗氧化损伤的影响
胡德宝,张也,张日欣,张宝修,李钟淑,方南洙
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  547-552.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.006
摘要 ( 204 )   HTML( )    PDF (871KB) ( 668 )  
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旨在研究WY14643对小鼠早期胚胎发育的影响,探讨WY14643对早期胚胎抗氧化损伤的机理。通过H2O2诱导建立胚胎氧化损伤模型,添加WY14643对胚胎进行体外培养,DCHFDA测定胚胎内部H2O2含量,分别用超氧化物歧化酶(SOD)和微量丙二醛试剂盒测定胚胎不同发育阶段SOD活性和丙二醛MDA含量,并观察后续胚胎发育情况。结果表明:(1)不同浓度WY14643处理2 h后,0.1 μmol•L-1 WY14643处理组4-细胞率、囊胚率显著高于其他各组(P<0.05);(2)经0.1 μmol•L-1 WY14643和H2O2联合处理后,其胚胎发育率显著高于单独H2O2处理组和对照组(P<0.05);(3)DCHFD 荧光检测发现,WY14643添加组胚胎内部H2O2水平显著低于其他各组(P<0.05);(4)经SOD、MDA检测,发现添加WY14643胚胎内部各时期SOD水平显著高于其他各组(P<0.05),MDA水平显著低于其他各组(P<0.05)。综上表明,氧化应激对早期胚胎发育是不利的,WY14643通过增加抗氧化酶SOD活性、降低脂质损伤等途径减少胚胎内部ROS,增加抗氧化能力,促进胚胎在体外更好地发育。

转基因克隆牛外源基因整合位点的检测
王敬姣,张明月,谭贝贝,张萃,李冬杰,戴蕴平,李宁,李世杰
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  553-558.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.007
摘要 ( 229 )   HTML( )    PDF (929KB) ( 965 )  
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确定外源基因的整合位点是获得转基因动物后的首要任务。本试验应用 TAIL-PCR得到了2头转入人溶菌酶基因克隆牛外源基因的整合位点,结果表明:2头转基因个体中外源基因均整合在受体基因组上,其中WS个体外源基因整合在牛24号染色体的基因组克隆(NW_003104566.1)中。YW个体中外源基因整合在牛16号染色体的基因组克隆(NW_003104440.1)中,整合位点位于LOC10030和RGL1基因之间。综上表明,在WS和YW个体中,外源基因的整合分别造成受体染色体238和228 bp核苷酸的缺失。4个整合片段(InS1~InS4)的末端均与拓扑异构酶I作用位点的共有序列相连。在WS个体中外源基因与染色体的整合连接处(InS1~InS3)存在1 nt的同源序列。在整合片段InS2、InS3、InS4中表现出共同的相似处,即均存在具有间隔的短的同源序列。

胎牛视网膜干细胞向神经细胞诱导研究
孙博,张文秀,吴芳春,马月辉,沙伟,关伟军
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  559-565.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.008
摘要 ( 222 )   HTML( )    PDF (6231KB) ( 956 )  
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旨在研究胎牛视网膜干细胞(Retinal stem cells,RSCs)的分离、培养、鉴定及向不同类型细胞诱导分化等的生物学特性。采用机械吹打法从胎牛眼睫状体部细胞中分离RSCs,通过免疫荧光方法鉴定RSCs标志物Nestin、Pax-6和Chx-10,并诱导其向星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞诱导分化,检测其多向分化潜能。结果表明,机械吹打法获得的胎牛RSCs不仅表达干细胞特有的标志,而且成功诱导分化为星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞。综上表明,胎牛RSCs具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能。为今后视网膜干细胞的研究提供相应的理论依据。

生长分化因子9及其受体在成年狗睾丸中的表达与定位
白瑞,赵鹂,李栋,于志慧,贺俊平
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  566-571.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.009
摘要 ( 297 )   HTML( )    PDF (2353KB) ( 654 )  
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本研究旨在探讨生长分化因子9(GDF9)及其受体在雄性成年狗睾丸中的定位与表达。采用RT-PCR、免疫组织化学法、免疫印迹法检测GDF9及其受体ALK5蛋白在成年狗睾丸中的表达与定位。GDF9蛋白在成年狗睾丸中的表达显示,GDF9阶段特异性地定位在成年狗睾丸生精上皮的圆形精细胞和粗线期精母细胞胞质。GDF9 I型膜受体ALK5蛋白在成年狗睾丸中的表达显示,ALK5主要定位在圆形精细胞。本研究显示,GDF9及其膜受体ALK5在成年狗睾丸中均有表达,提示,GDF9由圆形精细胞和粗线期精母细胞特异性分泌,通过旁分泌形式调控支持细胞间紧密连接及支持细胞与生殖细胞间的细胞连接,并以自分泌形式调控生殖细胞的生长与迁移。

动物营养
日粮磷水平对线性回归法测定磷真消化率的影响
刘静波,杨跃奎,何健
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  572-577.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.010
摘要 ( 260 )   HTML( )    PDF (610KB) ( 692 )  
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本试验旨在研究日粮磷水平对线性回归法测定豆粕中磷真消化率的影响。选用48头平均体重为(36.0±0.1 )kg生长公猪,采用2×3因子完全随机区组设计,随机分为6个处理,每个处理8个重复,每个重复1头猪。通过在半纯合日粮(低磷日粮,无玉米添加)和常规日粮(高磷日粮,含50.0%玉米)上添加3个水平豆粕(13.0%、26.0%和39.0%),研究日粮类型(低磷日粮和高磷日粮)对线性回归法测定豆粕中磷真消化率的影响。结果表明:随日粮豆粕水平增加,生长公猪的总磷摄入量、粪磷排泄量、可消化磷和存留磷量呈线性增加(P<0.01)。与低磷日粮相比,采食高磷日粮显著增加日粮总磷摄入量、粪磷排泄量、尿磷排泄量、可消化磷和存留磷(P<0.05)。通过使用线性回归法,生长猪采食高磷日粮测得豆粕中磷的真消化率为36.11%,显著低于采食低磷日粮测得结果43.38%(P<0.05)。由此可见,由半纯合日粮(低磷日粮)测定得出的豆粕中磷的真消化率显著高于常规日粮(高磷日粮)的测定值,因此在使用半纯合日粮测得饲料原料中磷真消化率的数据用于日粮配置时应考虑上述因素。

体外培养法研究三聚氰胺的降解规律及其对瘤胃发酵参数的影响
姜成钢,闫贵龙,屠焰,张乃锋,刁其玉
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  578-586.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.011
摘要 ( 193 )   HTML( )    PDF (431KB) ( 717 )  
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本试验采用体外培养法研究三聚氰胺(Melamine,MEL)对瘤胃发酵参数的影响。MEL的添加水平分别为0、2、10、50、250和1 250 mg•L-1,培养时间分别为0、1、2、4、6、8、12、24和48 h,测定了培养液中MEL的浓度变化,总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸含量和NH3-N浓度。结果表明:MEL在瘤胃液中培养48 h没有被降解(P>0.05),添加MEL降低了干物质降解率(DMD)(P<0.05),提高了丁酸的摩尔比例(P<0.05),MEL为1 250 mg•L-1时会降低丙酸摩尔比例(P<0.05),提高了乙∶丙酸比值(P<0.05)。MEL抑制瘤胃微生物生长,不能作为瘤胃微生物非蛋白氮来源。

高温环境下日粮中添加锌、维生素E和β-胡萝卜素对公牛精液品质和抗氧化指标的影响
李秋凤,李建国,吴云海,马亚斌,刘兴华,高艳霞,曹玉凤,刘廷玉
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  587-595.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.012
摘要 ( 308 )   HTML( )    PDF (444KB) ( 691 )  
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旨在研究高温季节日粮中添加维生素(维生素E和β-胡萝卜素)和锌对荷斯坦公牛精液品质、抗氧化指标的变化,探讨高温季节公牛维生素和锌的适宜添加量。本试验采用随机区组设计,选取体重相近(1 010±80)kg、采精正常、健康的纯种荷斯坦成年种公牛60头,随机分为4组,每组15头。4个处理组分别为Ⅰ组:对照组(基础日粮);Ⅱ组:基础日粮+100 mg•kg-1DM Zn;Ⅲ组:基础日粮+维生素(300 mg•kg-1DM维生素E和60 mg•kg-1DM β-胡萝卜素);Ⅳ组:基础日粮+100 mg•kg-1DM Zn+维生素(300 mg•kg-1DM维生素E和60 mg•kg-1DM β-胡萝卜素),试验期120 d。结果表明:添加维生素和锌可改善公牛的精液品质,显著提高鲜精活力(Ⅳ组0.649 vs对照组0.575)、精子密度(Ⅳ组15.16×108个•mL-1 vs对照组11.81×108个•mL-1)、冻精活力(Ⅳ组0.340 vs对照组0.283)、精子顶体完整率(Ⅳ组45.2% vs对照组41.8%),显著降低精子畸形率(Ⅳ组13.47% vs对照组16.81%),但对射精量无显著影响(Ⅳ组11.56 mL vs对照组10.33 mL)。添加维生素可显著提高Cu-Zn SOD的活性(P<0.01);添加锌可显著提高血清T-AOC(P<0.01)和GSH-Px活性(P<0.01);血清中MDA(P=0.053 5)和羟自由基(P=0.069 8)可随着维生素和锌的添加而降低。在4个试验组中,血清中Cu-Zn SOD、T-AOC和GSH-Px的活性Ⅳ组最高,而MDA的浓度以Ⅳ组最低。添加维生素可显著增加精清中总SOD(P<0.01)和T-AOC(P<0.01),日粮中添加锌可提高精清中Cu-Zn SOD的活力(P<0.05)。综上表明,夏季高温季节添加300 mg•kg-1DM维生素E、60 mg•kg-1DM β-胡萝卜素和100 mg•kg-1DM Zn可以改善精液品质。

不同纤维源对吉林白鹅肠道形态学发育的影响
李青竹,李润航,郑艳秋,娄玉杰
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  596-602.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.013
摘要 ( 310 )   HTML( )    PDF (2188KB) ( 704 )  
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为研究不同纤维源对吉林白鹅肠道形态学发育的影响,本试验分别以羊草和玉米秸秆作为日粮纤维源,选择56只吉林白鹅作为试验动物,应用组织切片技术分别对11、18、25、32、39、46、53日龄吉林白鹅小肠绒毛高度、隐窝深度、肌层厚度进行测定。结果表明:2个处理组均为空肠绒毛最长。2组肠道各段绒毛高度及肌层厚度在11~25日龄期间绝对生长值最高。羊草组鹅十二指肠及空肠绒毛高度、隐窝深度极显著高于玉米秸秆组(P<0.01)。玉米秸秆组鹅肠道各段肌层厚度高于羊草组。玉米秸秆组及羊草组鹅肠道各段绒毛高度/隐窝深度的比值总体上随日龄呈增长趋势,羊草组鹅十二指肠和空肠绒毛高度/隐窝深度的比值高于玉米秸秆组(P>0.05)。结果提示,本试验条件下,不同纤维源显著影响11~53日龄吉林白鹅肠道形态学发育,羊草组鹅十二指肠及空肠形态学发育优于玉米秸秆组。

预防兽医
猪流行性腹泻病毒、猪肠道病毒9型及猪嵴病毒三重RT-PCR检测方法建立及初步应用
任玉鹏,张斌,岳华,刘燕
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  603-608.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.014
摘要 ( 250 )   HTML( )    PDF (565KB) ( 810 )  
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旨在建立一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪肠道病毒9型(PEV-9)、猪嵴病毒(PKV)的三重RT-PCR法,并初步应用于临床样品检测。根据GenBank中PEDV和 PKV基因序列保守区设计2对引物,参照文献合成1对PEV-9引物,在同一体系进行RT-PCR扩增,对引物浓度、退火温度、灵敏度、特异性等进行优化,应用该法对采自四川省6个猪场46份样品进行检测。结果表明引物量分别为PEDV 0.5 μL、PEV-9 0.25 μL、PKV 0.25 μL,退火温度为55 ℃时扩增效果最理想;本方法最低检测量分别为PEDV 5.97 pg、PEV-9 0.11 pg、PKV 0.74 pg;用该方法对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪萨佩罗病毒、猪博卡病毒、猪环曲病毒、猪源大肠杆菌、猪源沙门菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌和空肠弯曲杆菌等病原进行RT-PCR扩增时,均无非特异性扩增条带出现。对46份腹泻样品的检测结果显示,PEDV感染率为76.1%、PEV-9为73.9%、PKV为39.1%,3种病原在同一样本检出率达29.1%,表明存在混合感染或协同致病的可能;与单项RT-PCR法相比,阳性样本的检出符合率均在91%以上,表明该方法具较高可信度。建立的方法可快速、准确地检测3种猪腹泻病毒性病原,为病原学诊断和分子流行病学调查提供了有效技术支持。

A型鸭肝炎病毒微基因组的构建
梁瑞英,胡文,李宁,缪秋红,毕庄莉,孟春春,李传峰,陈宗艳,刘光清
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  609-613.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.015
摘要 ( 229 )   HTML( )    PDF (688KB) ( 800 )  
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为研究A型鸭肝炎病毒(DHAV)非编码区的结构和功能,笔者拟构建该病毒的微基因组并对其进行初步鉴定。采用酶切的方法将萤火虫荧光素酶报告基因(fLuc)与A型鸭肝炎病毒的ORF进行替换;并在5′UTR上游插入海肾荧光素酶报告基因Rluc作为内参基因;同时还在Rluc上游引入锤头状核酶,3′UTR下游引入丁型肝炎核酶,至此得到了含有双报告基因的A型鸭肝炎病毒微基因组(pRluc-fLuc)。将pRluc-fLuc转染DF-1细胞,8 h便可以检测到报告基因的表达,24 h表达量达到峰值。上述结果表明,已经成功构建了A型鸭肝炎病毒微基因组,这为进一步研究病毒非编码区的结构和功能以及病毒的翻译或复制的调控机理提供了良好的技术平台。

SPF鸡感染禽白血病病毒A/B亚群后血清抗体与卵黄抗体的变化及其相关性
赵鹏,李德庆,董宣,徐海鹏,崔治中
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  614-620.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.016
摘要 ( 201 )   HTML( )    PDF (1182KB) ( 694 )  
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拟研究以卵黄抗体替代血清抗体检测判定SPF鸡群禽白血病病毒(ALV)感染状态的可行性。在人工接种ALV-A/B后的40只SPF鸡刚开产时,从21只抗体阳性鸡及19只抗体阴性鸡分别采集血清和卵黄并一一对应,比较卵黄不同稀释度与血清中ALV-Ab抗体的阴阳性吻合率及ELISA检测S/P值相关系数。另外36只同批次不攻毒的SPF鸡单独饲养作为对照,76只鸡在25~34周龄期间,每隔3周分别采集1次血清,每周采集1次种蛋,共采集了304份血清样品及836份卵黄样品。所有血清和卵黄抗体用IDEXX的ALV-Ab抗体ELISA检测试剂盒检测。血清按试剂盒规定的1∶500稀释,卵黄按预试验结果选定稀释度稀释。同一只鸡同一时段采集的血清和卵黄样品,严格在同一次ELISA试验中检测。结果表明,相对于血清抗体,将卵黄做1∶300稀释时,假阳性和假阴性最少,确定1∶300为卵黄最适稀释度。在25~34周龄,836份卵黄抗体的检测判定结果与304份血清抗体检测结果吻合率达94.7%,即这些血清抗体阳性鸡同时期采集的卵黄抗体也全部阳性,血清阴性鸡的卵黄抗体也均为阴性。结果提示疫苗生产企业可通过检测SPF种蛋的卵黄抗体来判断SPF鸡场对ALV的洁净度。

副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白的表达及其免疫原性分析
张飞,都启晶,张洋溢,文心田,黄小波,曹三杰
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  621-630.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.017
摘要 ( 201 )   HTML( )    PDF (2717KB) ( 677 )  
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运用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白(CPEP)基因,克隆至pMD-19T载体。经鉴定测序验证后,将获得的CPEP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建原核表达质粒pET-32a-CPEP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE以及Western blot分析免疫原性,纯化CPEP,并用纯化的蛋白免疫小鼠,检测其特异性血清IgG抗体水平及攻毒保护率。结果显示,成功构建原核表达质粒pET-32a-CPEP;SDS-PAGE分析结果显示,得到约35 ku的蛋白;Western blot分析显示,CPEP能与Hps SC-1阳性血清发生抗原抗体的特异性反应,证实该重组CPEP蛋白具有反应原性。以致死剂量的强毒株SC-1攻毒CPEP免疫小鼠,重组蛋白的免疫能够减缓发病,并表现出40%的保护率。重组蛋白CPEP的部分保护作用表明其可以作为免疫候选因子,为未来副猪嗜血杆菌标准化疫苗的研制奠定基础。

基于线粒体cox1和Cyt b基因对四川地区多头带绦虫的种群遗传多样性研究
郝桂英,杨应东,周英姿,杨光友
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  631-638.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.018
摘要 ( 275 )   HTML( )    PDF (2489KB) ( 711 )  
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为研究四川地区多头带绦虫的种群遗传多样性和系统发生关系,用线粒体cox1基因和Cyt b基因全序列分析了20株四川山羊源多头蚴(11株寄生于脑,9株寄生于肌间)的遗传变异,并构建了系统发育树。结果显示:20株多头蚴cox1和Cyt b基因全序列长度分别为1 623和1 068 bp,分别有59个和9个变异位点,其碱基变异率分别为0.1%~2.5%和0.1%~0.7%;分别检测到17个和6个单倍型,总的单倍型多样性分别为0.968±0.033和0.737±0.068,核苷酸多样性分别为0.005 98±0.001 33和0.003 06±0.000 79,平均遗传距离分别为0.006和0.003。构建的系统进化树均显示来源于脑部和肌间的20株四川山羊源多头蚴与多头带绦虫同在一个支系,均为多头带绦虫,且多头带绦虫四川分离株与伊朗、土耳其分离株亲缘关系较近,而与中国甘肃、中国广州、意大利分离株亲缘关系较远。研究结果表明线粒体cox1和Cyt b基因均可作为检测多头带绦虫种群遗传多样性的有效分子标记,且Cyt b基因的多样性水平低于cox1基因。

基础兽医
东北白鹅CD4基因的克隆及其胞外区的表达与抗血清的制备
张雪莲,魏双施,邵建伟,母晓宇,高明春,张文龙,马波,王君伟
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  639-646.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.019
摘要 ( 178 )   HTML( )    PDF (1124KB) ( 591 )  
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本研究根据GenBank公布的绿头鸭CD4(AF378701)基因序列设计引物,RT-PCR获得东北白鹅CD4基因。根据测序结果设计特异性引物,克隆得到东北白鹅CD4胞外区基因,并在pET-32a(+)/Rosetta(DE3) pLysS系统中进行原核表达。经IPTG诱导重组蛋白获得表达,Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,以纯化的重组蛋白为免疫原制备兔抗鹅CD4胞外区抗血清。I-ELISA、Western blot和流式细胞仪分析表明抗血清可特异识别重组蛋白以及分离获得的东北白鹅外周血T淋巴细胞,间接免疫荧光试验证实纯化的抗血清可特异性识别瞬时真核表达的鹅CD4胞外区蛋白。以上结果说明制备的抗血清可作为鹅CD4+ T淋巴细胞的检测试剂。

PCV2通过激活MyD88调控体外培养PAMs分泌IL-1β、IL-6和IL-10
韩俊源,郭华,张亚群,段滇宁,李晓琳,陈萌萌,张书霞
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  647-653.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.020
摘要 ( 263 )   HTML( )    PDF (2157KB) ( 691 )  
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试验选取6头猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原、抗体均为阴性的30日龄断奶仔猪,无菌分离肺泡巨噬细胞(AMs),分4组进行体外培养:对照组、髓样分化因子88(MyD88)干扰组(干扰组)、PCV2感染组(PCV2组)、PCV2感染-MyD88干扰组(PCV2-干扰组)。采用小干扰RNA(siRNA)方法使MyD88基因沉默,并分别于培养后0、6、12、24和48 h收集细胞及培养上清液。用荧光定量PCR法检测干扰效率,Western Blot方法检测细胞内MyD88蛋白的表达变化,ELISA方法检测培养上清液中IL-1β、IL-6和IL-10的动态变化。结果显示,siRNA 能使78%的MyD88基因沉默,并显著影响其蛋白表达;AMs中MyD88表达量,PCV2组从6 h开始显著升高(P<0.05),PCV2-干扰组与PCV2组相比在12、24、48 h差异极显著(P<0.01)。培养后各时间点,PCV2均能明显促进AMs分泌IL-1β(P<0.01或P<0.05),PCV2-干扰组和PCV2组相比,IL-1β的分泌量均显著降低(P<0.05)。PCV2能显著增加感染后6和12 h IL-6的分泌量(P<0.01),PCV2-干扰组和PCV2组相比,IL-6的分泌量在6和12 h显著降低(P<0.05)。PCV2明显促进感染后12、24和48 h AMs分泌IL-10的能力(P<0.01),PCV2-干扰组和PCV2组相比,IL-10的含量在24和48 h均极显著的降低(P<0.01)。结果表明,PCV2可引起体外培养的PAMs分泌 IL-1β、IL-6和IL-10发生不同的变化,而MyD88是引起这些变化的重要调节因子。

IBDV感染鸡后外周血淋巴细胞PD-1及其配体PD-L1/PD-L2转录变化的初步分析
王爱国,孙国鹏,李博文,岳锋,张艳芳,朱艳平,银梅,杨媛,郭东光,王选年
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  654-660.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.021
摘要 ( 158 )   HTML( )    PDF (1010KB) ( 572 )  
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建立鸡PD-1及配体PD-L1/PD-L2 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法,并用所建立的方法研究和分析雏鸡感染IBDV的不同阶段体内PD-1及配体PD-L1/PD-L2 的转录变化。根据 GenBank中PD-1、PD-L1和PD-L2的基因序列,分别设计特异引物扩增目的基因,得到各自阳性克隆质粒,以阳性质粒作为标准品建立标准曲线,并进行敏感性、特异性和重复性试验。应用所建立的实时荧光定量RT-PCR方法对4周龄健康雏鸡人工感染IBDV后第3、5、7、10天PBMC中PD-1及配体PD-L1/PD-L2 的转录变化进行检测,同时用半定量RT-PCR方法以及IBDV快速检测试纸条对病毒感染后各时间点法氏囊组织中IBDV的载量进行检测。结果表明,建立的方法在1×101~1×109 copies·μL-1模板范围内具有良好的线性关系(R2>0.99),可检测至少101 copies·μL-1的阳性标准样品,且具有较好的特异性和重复性。IBDV感染后,病毒在雏鸡体内复制逐渐增加,至第5天病毒载量达到最高。实时荧光定量RT-PCR检测结果表明,PD-1及配体PD-L1/PD-L2 在病毒感染后不同阶段转录量均有所升高,其中PD-1在病毒感染后第7天显著(P<0.05)升高,在病毒感染后第3天PD-L1极显著(P<0.01)升高,PD-L2显著(P<0.05)升高。本研究成功建立了PD-1及配体PD-L1/PD-L2 实时荧光定量RT-PCR检测方法;并应用该方法初步分析了PD-1及配体PD-L1/PD-L2 在IBDV感染不同阶段的转录变化,发现IBDV感染后不同阶段PD-1及配体PD-L1/PD-L2 的转录均升高,且PD-L1、PD-L2 的转录先于PD-1升高,并与病毒载量呈正相关。

孕激素受体在雌性山羊颈前神经节的分布
郭晓,李强,徐永平,金秀芳,陈文东,王志豪,董伟,范洁
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  661-665.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.022
摘要 ( 185 )   HTML( )    PDF (1808KB) ( 538 )  
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为研究雌性山羊颈前神经节(SCG)是否具备接受孕激素作用的条件,从而推测孕激素是否参与靶器官内分泌过程的神经调控,本试验采用免疫组织化学SP法研究雌性山羊SCG中孕激素受体(PR)的分布特点。结果显示在雌性山羊的SCG中,PR免疫反应阳性产物广泛分布,在神经元胞体、施万细胞、卫星细胞、神经纤维中均有不同程度的着色。其中神经元均为PR阳性,细胞膜和细胞质呈黄褐色,PR为中等阳性,而细胞核呈棕褐色为强阳性。另外施万细胞、支持细胞和神经纤维中也有淡黄色、弱阳性的PR阳性产物。图像分析表明,神经元胞体PR的相对表达量极显著(P<0.01)高于其他非神经成分。以上结果表明雌性山羊颈前神经节是孕激素作用的主要靶器官之一,提示孕激素可能作用于SCG交感节后神经元,从而参与SCG支配的靶器官的功能活动,而SCG内神经元上的PR有可能作为一个节点协调孕激素对内脏器官的内分泌调节和自主神经对内脏器官的神经调节。

复方人参皂苷纳米乳的制备及其急性毒性研究
曹发昊,欧阳五庆,王艳萍
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  666-671.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.023
摘要 ( 252 )   HTML( )    PDF (1437KB) ( 625 )  
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利用纳米化技术,将人参皂苷和盐酸左旋咪唑组成复方人参皂苷纳米乳,对其组成和急性毒性进行研究。利用伪三元相图筛选出用于制备复方人参皂苷纳米乳的空白纳米乳;研究不同含药量纳米乳对免疫抑制小鼠脾T淋巴细胞增殖的影响,根据免疫增强作用较强的含药纳米乳,确定复方人参皂苷纳米乳的组成;分别用透射电镜、激光粒度仪和小鼠灌胃试验对其形态、粒径和急性毒性进行研究。结果显示,确定的复方人参皂苷纳米乳组成:Solutol®HS-15、甘油、PEG400、IPM、蒸馏水,其质量比为25.33∶10.14∶2.53∶6∶56,GS和LH含量均为30 mg·mL-1;它是黄色透明O/W纳米乳,液滴呈球形,平均粒径为23.08 nm,粒度分散指数为0.237,小鼠灌胃LD50为402.85 mg·kg-1。本试验成功制备了复方人参皂苷纳米乳,为进一步开发纳米化免疫增强剂提供了依据。

临床兽医
大鼠热结肠道型气分证模型的构建及肠道结构、IEL和GC数量的变化研究
王自力,贺庭祯,张翥,王陈超,王明周,涂君平,谢尔玛,张家骅,别应堂
畜牧兽医学报, 2014, 45(4):  672-678.  doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.04.024
摘要 ( 181 )   HTML( )    PDF (2932KB) ( 632 )  
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为了建立大鼠热结肠道型气分证模型,通过给大鼠灌服热性中药、自身粪便悬液及腹腔注射灭活大肠杆菌菌液,分别观察和检测大鼠临床症状、采食量、饮水量、体重、体温变化,并对大鼠肠道组织结构、IEL和GC数量变化进行研究。结果表明,灌服温热性中药、自身粪便及注射灭活大肠杆菌液后5 h时大鼠临床症状、采食量、饮水量及体温等均符合中兽医热结肠道型气分证特征,肠道组织结构变化以注射灭活大肠杆菌后5 h病理损伤最为明显,且十二指肠、空肠、回肠的IEL和杯状细胞数量均出现显著下降。即确定灌服12 d热性中药及2 d大鼠自身粪便后,腹腔注射灭活大肠杆菌后5 h可成功制作出热结肠道型气分证大鼠模型。