pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞建系的研究

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.08.007

畜牧兽医学报 ›› 2014, Vol. 45 ›› Issue (8): 1253-1259.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2014.08.007

pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞建系的研究

黄晓梅¹，张蕾¹，左其生¹，施青青¹，李东¹，汤贝贝¹，张亚妮¹，宋九州²，李碧春^1*

（1.扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物繁育与分子设计重点实验室，扬州 225009；2.Animal and Avian Science Dept.University of Maryland，College Park，MD 20742）

收稿日期:2014-01-09 出版日期:2014-08-23 发布日期:2014-08-23
通讯作者: 李碧春，教授，博士，主要从事动物胚胎工程与遗传工程研究，E-mail：yubcli@yzu.edu.cn
作者简介:黄晓梅（1986-），女，山东潍坊人，硕士生，主要从事动物胚胎工程与遗传工程研究，E-mail：hxm761145067@sina.com
基金资助:
国家自然科学基金（31272429；31301959）；江苏省研究生培养创新工程(CXLX12_0934)

Research on Establishing Chicken Embryonic Stem Cell Line by pEGFP-hTERT Transfection

HUANG Xiao-mei¹，ZHANG Lei¹，ZUO Qi-sheng¹，SHI Qing-qing¹，LI Dong¹，TANG Bei-bei¹，ZHANG Ya-ni¹，SONG Jiu-zhou²，LI Bi-chun^1*

（1.Key Laboratory of Animal Breeding Reproduction and Molecular Design for Jiangsu Province，College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China；2.Animal and Avian Science Dept.University of Maryland，College Park，MD 20742，America）

Received:2014-01-09 Online:2014-08-23 Published:2014-08-23

摘要/Abstract

摘要：

本研究旨在通过构建重组质粒pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells，cESCs)，优化鸡胚胎干细胞培养体系，以期构建鸡胚胎干细胞株或细胞系。在获得hTERT基因后，构建重组质粒pEGFP-hTERT，并利用FuGENE^@HD转染鸡成纤维细胞(DF-1)，转染24 h后，荧光显微镜检测；再以80% BRL-CM（大鼠肝细胞条件培养基）与20% 的ES基础培养液混合的条件培养基培养分离的cESCs，添加10 μmol•L^-1维生素C，AKP染色以及相关表面抗原SSEA-1、SOX2和OCT4检测鉴定后，以G418筛选pEGFP-hTERT转染的cESCs，传代培养后荧光定量PCR检测相关干性基因的表达水平。结果表明：维生素C可以促进cESCs增殖，pEGFP-hTERT转染的DF-1细胞中可以检测到绿色荧光表达，pEGFP-hTERT转染的cESCs可持续传至10代以上，且仍保持未分化状态，干细胞表面特异性抗原检测呈阳性，且相关干性基因的表达水平差异不显著（P>0.05）。综上表明：pEGFP-hTERT转染的cESCs在80%BRL-CM结合外源因子的作用下，能够持续稳定传至10代且仍保持未分化状态，可应用于鸡胚胎干细胞的永生化和细胞系建立。

Abstract:

This experiment was conducted to transfect chicken embryonic stem cells with recombinant plasmid pEGFP-hTERT，optimize culture system of chicken embryonic stem cells，and establish embryonic stem cell lines.hTERT gene was obtained and then subcloned into pEGFP-N1 to construct eukaryotic expression vector pEGFP-hTERT.cESCs were transfected with pEGFP-hTERT after transfection DF-1 cells，which were cultured with 80% conditioned medium，20% ES decarboxylase basal medium and 10 μmol•L^-1 vitamin C.After detection with AKP staining and associated specific surface antigen SSEA-1，SOX2 and OCT4，cESCs were selected with G418 and detected by real-time fluorescent quantitative PCR.The results showed that vitamin C could promote cESCs proliferation，green fluorescence could be detected in DF-1 cells aftert transfected with pEGFP-hTERT，cESCs transfected with pEGFP-hTERT could be passaged to 10th generation and remained undifferentiated state，and stem cell surface specific antigen detection was positive，as well there were no significant differences in expression levels of related genes（P>0.05）.The results indicated that cESCs could be passaged to 10th generation consistently，and remained undifferentiated state，which were transfected with pEGFP-hTERT and cultured with 80% BRL-CM added vitamin C.This would be used in embryonic stem cells immortalization and establishing cell lines.

中图分类号:

S831
S814.8

黄晓梅，张蕾，左其生，施青青，李东，汤贝贝，张亚妮，宋九州，李碧春. pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞建系的研究[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(8): 1253-1259.

HUANG Xiao-mei，ZHANG Lei，ZUO Qi-sheng，SHI Qing-qing，LI Dong，TANG Bei-bei，ZHANG Ya-ni，SONG Jiu-zhou，LI Bi-chun. Research on Establishing Chicken Embryonic Stem Cell Line by pEGFP-hTERT Transfection[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2014, 45(8): 1253-1259.

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