畜牧兽医学报

猪Suv39h2基因的cDNA克隆及原核表达

刘丽娜;彭健;郑嵘;刘敏;蒋思文

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 611-616.

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以人Suv39h2基因mRNA序列为基础，利用“电子克隆”获得猪的部分cDNA序列，并用RT-PCR技术从肌肉组织中扩增得到猪Suv39h2基因1 291 bp的cDNA序列，将其重组于pGEX-KG原核表达载体中，经酶切、序列鉴定正确后，用该重组质粒转化大肠杆菌BL21，经异丙基B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，并用SDS-PAGE 电泳进行检测，优化后的最佳条件为IPTG 诱导4 h，其浓度为0.7 mmol·L^-1，并主要以包涵体的形式存在。Western blotting 检测发现在约66 ku处有一条特异带，与预测的大小一致。猪Suv39h2基因的克隆和表达研究，为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。

猪Suv39h2基因的cDNA克隆及原核表达

刘丽娜;彭健;郑嵘;刘敏;蒋思文

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 611-616. doi:

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Myostatin基因5′调控区的多态与猪生长性能的关系

吴俊红;武艳群;赵晓枫;吴旧生;徐宁迎

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 617-621.

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采用PCR-RFLP技术对45头金皮(金华猪×皮特兰猪)F₂代猪Myostatin基因5′调控区的多态性进行检测，根据酶切结果将其分为AA、TT和AT 3种基因型，结果显示A等位基因频率为0.467，T等位基因频率为0.533。对这些个体进行生长和屠宰性能测定以及对背最长肌进行免疫组化分析，进而采用SPSS程序分析Myostatin不同基因型对金皮F2代猪生长性状、肌纤维组织学特性及胴体性状的影响。结果表明：Myostatin基因对金皮F₂代猪肌纤维直径、MHC I型肌纤维比例、肩部背膘厚、眼肌肉色亮度及出生至4月龄平均日增质量的影响均达到显著水平(P<0.05)。

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吴俊红;武艳群;赵晓枫;吴旧生;徐宁迎

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 617-621. doi:

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猪SGCB基因多态性及其与胴体性状的关联分析

符亚原;雷明刚;潘刚;程蕾;何君贤;李凤娥;左波;熊远著

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 622-626.

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本研究检测了大白猪、长白猪和梅山猪SGCB基因第4外显子上的G/A突变，并进行了多态性研究。采用改进的扩增受阻突变系统-PCR (ARMS-PCR)技术在3个不同猪种和“大白×梅山”F₂代资源家系中进行遗传分析，结果表明，等位基因A和G在4个群体中分布平衡。对266头“大白×梅山”F2代资源家系中SGCB基因多态性与胴体性状进行关联分析。结果表明：该位点AA基因型对活体瘦肉率存在极显著影响（P<0.01），GG基因型对眼肌高存在极显著影响(P<0.01)。

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畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 622-626. doi:

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贵州地方猪品种HSL基因多态性与屠宰性状的关联性研究

王安娜;冉雪琴;王嘉福;夏先林

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 627-632.

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本研究旨在分析HSL基因多态性与地方猪品种瘦肉率之间的相关性。采用RFLP方法，以二元杂交猪（长白猪×大约克猪）为对照，对贵州地方猪品种糯谷猪和萝卜猪的HSL基因进行多态性分析。结果表明，贵州地方猪品种HSL基因外显子1中存在BsaH I酶切片段长度多态性，从3个猪群体中都检测到AA、AB和BB基因型，克隆测序后证实，A等位基因于第442 bp处发生了单碱基突变（G→A），导致氨基酸Val→Ile替换。地方猪品种以A等位基因占优势，杂交猪以B等位基因占优势。将猪胴体性状与HSL基因型之间进行关联分析，结果显示大部分年龄段的猪品种中，BB、AB和AA 3种基因型的瘦肉率和眼肌面积均表现出从高到低的变化趋势，而背膘厚则完全相反。结果提示，HSL外显子1的B等位基因具有增加胴体瘦肉率和眼肌面积、降低背膘厚的遗传效应，可作为贵州地方猪品种瘦肉率的分子标记。

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王安娜;冉雪琴;王嘉福;夏先林

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 627-632. doi:

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体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因（sFat-1）的猪胚胎

冯冲;周艳荣;龙川;刘晓;陈红星;潘登科;杨博辉

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 633-638.

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本研究通过脂质体介导的方法将来源于线虫C. Briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)转染至大白猪胎儿成纤维细胞。采用600 μg·mL^-1 G418药物浓度，经连续10 d筛选及PCR、RT-PCR鉴定，获得11个转基因阳性细胞克隆。以体外成熟42 h的猪卵母细胞与转基因细胞构建重构胚。经体外培养后观察，转基因克隆胚胎与非转基因胚胎的卵裂率 (76.6%±4.1% vs. 81.6%±3.1%) 和囊胚率 (10%±1.97% vs. 9.7%±1.4%) 均无显著差异 (P>0.05)。采用放线菌酮进行化学二次激活时，胚胎的囊胚率显著高于采用电二次激活胚胎 (20.6%±0.89% vs. 10%±1.97%，P<0.05)，但二者的卵裂率并无显著差异 (72.4%±4.96% vs. 76.6%±4.1%，P>0.05)。研究表明，通过脂质体介导的方法, 可以获得转sFat1基因大白猪胎儿成纤维细胞系；以该细胞系为核供体构建的转基因克隆胚胎与非转基因克隆胚胎的发育能力无显著差异；二次激活采用放线菌酮进行化学激活能够显著提高胚胎的囊胚发育率。

体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因（sFat-1）的猪胚胎

冯冲;周艳荣;龙川;刘晓;陈红星;潘登科;杨博辉

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 633-638. doi:

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小型猪生长激素基因启动子区SNPs分析

郑茂恩;潘登科;冯书堂;刘晓;叶绍辉;浦亚斌;何晓红;赵倩君;关伟军;马月辉;

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 639-644.

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利用PCR-SSCP方法检测4种小型猪（五指山猪、巴马猪、香猪和藏猪）和2种中大型猪（达兰猪和长白猪）生长激素（GH）基因的单核苷酸多态性。发现小型猪中有3处碱基突变发生在5′调控区，对基因型和等位基因频率进行分析，4种小型猪生长激素5′侧翼区基因位点中，等位基因A和D为优势等位基因，与达兰猪和长白猪中的分布差异显著(P<0.05)。以上结果表明猪品种间的体型差异可能与GH基因5′调控区的基因突变和前导肽中的氨基酸变异有关。

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郑茂恩;潘登科;冯书堂;刘晓;叶绍辉;浦亚斌;何晓红;赵倩君;关伟军;马月辉;

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 639-644. doi:

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不同处理牛卵丘/颗粒细胞作为核供体对克隆胚发育的影响

姚雅馨;李向臣;张勇;关伟军;马月辉

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 645-651.

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本研究利用TSA (Trichostatin A)、ROS (Roscovitine)、血清饥饿和接触抑制方法处理牛卵丘/颗粒细胞，检测处理前后细胞乙酰化水平、周期分布及其对重组胚发育能力的影响，为提高核移植效率提供理论基础。分别采用上述方法处理牛卵丘/颗粒细胞，首先对处理的细胞形态及活率进行观察，并利用流式分选技术检测处理细胞的周期分布，再通过间接免疫荧光法检测经上述不同处理前后细胞乙酰化水平变化，最后以上述处理细胞作为核供体构建重组胚，比较重组胚发育水平的不同。试验结果显示，经上述处理的卵丘/颗粒细胞形态良好，活率均保持在94%以上；TSA处理卵丘/颗粒细胞后，其乙酰化水平较对照组和其他处理组明显增加（P<0.05），经ROS处理的卵丘/颗粒细胞乙酰化表达水平同样高于对照组（P<0.05），但仍低于TSA处理组（P<0.05），但经血清饥饿处理的卵丘/颗粒细胞乙酰化水平较对照组明显降低（P<0.05）；利用TSA处理卵丘/颗粒细胞24 h后，细胞被明显抑制在G0/G1期，且较其他处理组的抑制现象更加明显(P<0.05)；并且，经TSA处理后的卵丘/颗粒细胞充当供体细胞，其卵裂率和囊胚率较对照组明显增加（P<0.01, （85.2±3.4）% vs （68.6±6.7）%; （30.2±5.7）% vs （10.4±8.3）%）。经TSA处理的牛卵丘/颗粒细胞，与其他处理组相比，乙酰化水平较高，细胞形态良好，细胞周期被明显抑制在G0/G1期，且获得了较高的卵裂率和囊胚率，作为供体细胞的处理方式较为适合。

不同处理牛卵丘/颗粒细胞作为核供体对克隆胚发育的影响

姚雅馨;李向臣;张勇;关伟军;马月辉

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 645-651. doi:

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马岗鹅产蛋-就巢周期内卵泡发育的内分泌调控

刘容珍;黄运茂;李万利;田允波;施振旦

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 652-657.

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旨在探讨马岗鹅产蛋就巢周期内卵泡发育的内分泌调控机制。试验1：观察了马岗鹅产蛋就巢周期内PRL、LH、P4和INB水平的变化和就巢期(第1天)、就巢终止期（第10天）、开产期（第25天）、产蛋高峰期（第40天）、停产期（第55天）和就巢期（第70天）卵泡的发育。试验2：在对马岗鹅终止就巢时（第1天）主动免疫重组鸡PRL蛋白（1 mg·只^-1），并在开产前（第23天）和产蛋高峰期（第45天）加强免疫（0.8和0.5 mg·只^-1），同时从第33天将每天光照由11 h增至16 h，观察对马岗鹅产蛋和就巢的影响。试验1结果表明，随着就巢的终止，PRL水平下降，LH、P4和INB水平上升。PRL在开产前降至最低，开产后又逐渐上升，就巢期达最高；LH则在开产前和产蛋期呈现两波分泌峰；P4和INB与PRL呈相反变化，在产蛋高峰期最高，就巢期最低。鹅群在第24天恢复产蛋，开产前有约10枚大白卵泡（LWF）发育为小黄卵泡（SYF）和大黄卵泡（LYF）；在约30 d的产蛋期内，平均每只产蛋约8枚，产蛋结束后90%的鹅发生就巢。试验2结果表明，对马岗鹅主动免疫PRL蛋白一定程度推迟（P<0.05）了开产后产蛋率的上升, 并一定程度抑制就巢的发生；而在延长光照15 d后，免疫组的产蛋和就巢则快速升至与对照组相当水平。整个试验期，2组累计就巢均达到100%，但免疫组比对照组多产蛋1枚 (8.0 vs 7.0）。结果提示，PRL和LH的交替分泌调控马岗鹅的产蛋就巢周期；卵泡发育时分泌的INB，以及由P4促进分泌的PRL，调节周期中卵泡发育和产蛋的数量。PRL不仅促进就巢发生并导致周期内较低等级卵泡的闭锁，可能还在开产前后具有促进卵泡发育和产蛋的作用。

马岗鹅产蛋-就巢周期内卵泡发育的内分泌调控

刘容珍;黄运茂;李万利;田允波;施振旦

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 652-657. doi:

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鹅Pit-1基因部分序列多态性分析

程金花;赵文明;乔娜;王学斌;姜庆林;张康宁;陈国宏

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 658-663.

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根据鸡Pit-1 mRNA 和基因组序列设计1对引物，以籽鹅、狮头鹅、皖西白鹅、四季鹅、浙东白鹅和朗德鹅6个群体的DNA为模板，扩增鹅Pit-1基因的部分片段。结果发现该片段存在2个插入/缺失突变，共出现3种基因型，分别为AA、AB和BB；与AA基因型相比，BB基因型分别在扩增片段的132和145 bp后插入3和13 bp。所有群体在该突变位点上的等位基因频率均处于哈代温伯格平衡状态（P>0.05）；朗德鹅群体基因型分布与其他5个鹅群体均存在极显著差异（P<0.01）；籽鹅和狮头鹅群体内基因型的分布与其他3个鹅群体存在显著差异（P<0.05）。在狮头鹅和朗德鹅群体内，等位基因A为优势等位基因，而在皖西白鹅、四季鹅和浙东白鹅群体内等位基因B为优势等位基因。

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程金花;赵文明;乔娜;王学斌;姜庆林;张康宁;陈国宏

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北京鸭H-FABP多态与屠体性状相关分析

朱祥云;;杨晓刚;;王杰;刘小林;侯水生;黄苇;俞俊英;赵玲

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 664-669.

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应用聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）的方法，以心脏-脂肪酸结合蛋白基因（H-FABP）为侯选基因，对6周龄北京鸭的3个群体（区分公母）共300个个体进行SNP分析。结果发现HFABP第3内含子以本试验采用的引物碱基为第一碱基的第156碱基处发生1个C/G突变，此突变对Z4群体胴体质量、皮脂质量、皮脂率和全净膛质量有显著影响，并且对Z4（公）群体中胸肌质量、腿肌质量以及骨架质量有显著影响，因此可以将心脏-脂肪酸结合蛋白基因作为影响北京鸭Z4群体屠体性状的侯选基因。

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畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 664-669. doi:

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应用聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）的方法，以心脏-脂肪酸结合蛋白基因（H-FABP）为侯选基因，对6周龄北京鸭的3个群体（区分公母）共300个个体进行SNP分析。结果发现HFABP第3内含子以本试验采用的引物碱基为第一碱基的第156碱基处发生1个C/G突变，此突变对Z4群体胴体质量、皮脂质量、皮脂率和全净膛质量有显著影响，并且对Z4（公）群体中胸肌质量、腿肌质量以及骨架质量有显著影响，因此可以将心脏-脂肪酸结合蛋白基因作为影响北京鸭Z4群体屠体性状的侯选基因。

酸性纤维素酶CBHⅡ基因与非抗性穿梭表达载体的重组及在乳酸杆菌的表达及其活性检测

赵莹;孙哲;刘燕;胡后银;陈大芳;娄玉杰;张宏福

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 670-675.

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以SmaI和SphI双酶切pMD18-T-CBHⅡ和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t，胶回收酸性纤维素酶CBHⅡ基因和载体大片段，并将纯化的CBHⅡ基因和表达载体pW425t大片段进行连接，构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-CBHⅡ。将pW425t-CBHⅡ转化至thyA基因缺陷型的乳酸杆菌感受态细胞中，通过质粒提取、酶切鉴定、PCR鉴定、测序分析和生长功能弥补筛选阳性克隆。SDS-PAGE分析，可见约49.6 ku的蛋白，并且刚果红染色显示重组乳酸杆菌可产生明显的水解圈。

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畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 670-675. doi:

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免疫应激对仔猪肠道发育及胰高血糖素样肽-2分泌的影响

车炼强;张克英;丁雪梅;陈代文

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 676-682.

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通过2个试验研究了断奶仔猪胰高血糖素样肽-2（GLP-2）分泌规律和免疫应激对断奶仔猪肠道发育及GLP-2分泌的影响。试验1研究表明，仔猪断奶厌食降低了GLP-2的分泌，而随着采食量的恢复GLP-2分泌增加。试验2研究发现，免疫应激导致仔猪采食量急剧下降（P<0.01），并使全身免疫系统活化；同时，试验前期（0～4 d）GLP-2分泌受免疫应激的影响而显著下降（P<0.05），并影响了仔猪肠道形态学（绒毛高度/隐窝深度）和肠黏膜乳糖酶、蔗糖酶的活性。免疫应激条件下仔猪肠道黏膜杯状细胞数量也有下降的趋势。结果表明，免疫应激造成仔猪采食量下降和全身免疫系统活化，并引起GLP-2分泌不足，从而影响肠道发育。

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车炼强;张克英;丁雪梅;陈代文

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 676-682. doi:

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能量水平和来源对后备母猪血液代谢产物、激素分泌及卵泡液成分的影响

周东胜;吴德;卓勇;王延忠;谭现义;周平

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 683-690.

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选取54头体质量（59±4.2）kg的长白×大白杂交母猪，采用3×2因子设计，研究日粮能量水平和来源对血液代谢产物、激素分泌及卵泡液成分的影响。3个能量水平分别为NRC推荐能量需要的87.5%、100%和112.5%；各能量水平下分别添加淀粉和油脂。第2个发情期开始后的第18和19天分别收集血样和卵泡液。结果表明，能量水平对血液中葡萄糖、甘油三酯等代谢产物的影响差异不显著(P>0.05), 能量来源对血液中葡萄糖浓度无显著影响(P>0.05)，但日粮中添加脂肪极显著提高了血液中甘油三酯、总胆固醇浓度（P<0.01)。高能组血液中食后胰岛素浓度曲线下面积（Ins AUC）、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、瘦素（Leptin）浓度显著高于低能组(P<0.05)，淀粉和脂肪组间差异不显著(P>0.05)。提高能量水平显著增加促黄体素（LH）的脉冲分泌(P<0.05)，日粮中添加脂肪显著提高血液中雌二醇（E2）浓度(P<0.05)。随能量水平提高，显著增加大卵泡数和卵泡液中IGF-Ⅰ、E₂浓度 (P<0.05)，能量来源对大卵泡数和卵泡液成分影响不显著(P>0.05)。由结果分析可知, 日粮提高能量水平促进血液中代谢激素IGF-Ⅰ、LH的分泌并增加大卵泡数及卵泡液中IGF-Ⅰ和E₂浓度，日粮中添加脂肪提高血液中甘油三酯、总胆固醇浓度并促进雌激素的分泌。

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畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 683-690. doi:

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猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达及其亚细胞定位的初步分析

吕茂杰;冯力;时洪艳;陈建飞;孙东波;申识川;崔小辰;王承宝;范秀萍;

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 691-696.

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以构建的含有编码猪流行性腹泻病毒CV777株核衣壳蛋白(N)基因的阳性质粒pMDT-18-N为模板，用含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点的上、下游引物扩增获得N基因，该PCR产物经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到经相同双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)中，经过酶切鉴定和测序鉴定，将构建的重组质粒命名为pcDNA3.1(+)-N，且未发现碱基的缺失和插入。用脂质体法将pcDNA3.1(+)-N转染Vero E6细胞, 在48 h后, 以针对猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白的鼠源`多抗血清进行Western blot、免疫荧光检测，并运用共聚焦显微镜分析N蛋白的亚细胞定位。结果表明N基因能在真核细胞Vero E6中正确表达，共聚焦分析结果表明N蛋白在细胞质和细胞核中定位。

猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达及其亚细胞定位的初步分析

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持续感染黄牛体内口蹄疫病毒抗原性和血清中和特性分析

沈小燕;丛国正;刘湘涛;常惠芸;林彤;邵军军;尚佑军;谢庆阁

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 697-705.

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以口蹄疫病毒 O/Akesu/58毒株感染黄牛获得口蹄疫病毒持续带毒动物，定期分离黄牛食道/咽喉部黏性液体（O/P液）和血清，研究病毒分离毒株抗原基因变异及其血清中和特性，从基因水平和血清学方面研究口蹄疫病毒持续感染分离株的抗原变异性。用RT-PCR扩增分离株抗原基因VP1，分析VP1基因变异情况；用微量血清中和试验检测了口蹄疫病毒持续感染血清与对应动物分离毒株的中和特性，并用液相阻断ELISA方法检测了口蹄疫病毒持续感染血清的抗体水平变化，并对其相关性进行了分析。结果发现所有持续感染分离毒株的VP1基因核苷酸和氨基酸同源性都在98％以上，没有碱基缺失或插入现象；与O/Akesu/58的核苷酸同源性仅为85％左右，氨基酸同源性也仅为90%。持续感染分离株VP1基因有多处位点发生突变，其中有16个核苷酸位点发生一致突变，但只有2个位点造成氨基酸突变(I56→T、A210→E)；而持续感染分离毒株有4个核苷酸位点和3个氨基酸位点发生了颠换突变；同时证实不同时间分离株与对应血清都能相互中和，且中和作用能力随着时间延续呈下降趋势，最低为1∶80，具有较强的中和能力，这与LPB-ELISA检测结果基本一致。这说明口蹄疫病毒持续感染分离株抗原变异不显著，没有变异到动物自身血清不能识别的程度，而且分离毒株与自身动物血清具有较强的中和特性；在持续感染过程中，动物血清保持高水平抗体滴度，且持续感染毒株的分离与否与抗体水平没有显著相关性。

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沈小燕;丛国正;刘湘涛;常惠芸;林彤;邵军军;尚佑军;谢庆阁

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 697-705. doi:

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口蹄疫病毒Asia1/JS/China/2005株基因组全长感染性克隆的构建

李平花;白兴文;卢曾军;孙普;郭建宏;曹伟军;刘湘涛;殷宏;刘在新

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 706-711.

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利用长距离RT-PCR技术扩增病毒基因组3′端覆盖口蹄疫病毒Asia1/JS/China/2005株近全长的3个片段（共约7.5 kb），并利用单一酶切位点将其分别克隆到pBluescriptSK+ 载体上。利用融合PCR扩增到基因组5′端含有15个C碱基的基因片段（约700 bp），并将其连接至pGEMT载体。最后将这4个片段的阳性克隆装配至剔除T7启动子的低拷贝载体pcDNA3.1/Zeo（+）中构建该病毒株的全长cDNA克隆。以构建的FMDV Asia1/JS/China/2005株全长cDNA为模板, 使用T7RNA 聚合酶在体外转录得到病毒RNA，通过脂质体将其导入BHK细胞获得拯救病毒。对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析结果证实,通过体外转录获得了具有感染性的口蹄疫病毒。该株感染性克隆的构建为深入研究口蹄疫病毒的致病机制及研制新型疫苗等奠定了基础。

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表达传染性支气管炎S1基因和IFN-γ基因重组鸡痘病毒安全性与最适免疫剂量分析

石星明;王云峰;王玫;兰德松;任刚;李继松;曾伟伟;孙妍;刘胜旺;童光志

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 712-716.

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对共表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因和II型干扰素基因的重组鸡痘病毒（rFPV-IFNγS1）冻干疫苗进行安全性和最适免疫剂量的研究。取冻干疫苗，加生理盐水恢复至冻干前体积，分别取0.1 mL经翅内侧无血管处皮下接种1周龄SPF 鸡，接种剂量为1.0×10⁵PFU，接种后3 d出现局部反应，5 d局部肿胀达到最大，接种鸡无其它全身反应，精神、食欲以及发育等均不受影响，说明重组病毒对实验鸡是安全的。将重组疫苗用生理盐水作倍比稀释后翅内侧无血管处皮下接种4周龄SPF鸡，接种剂量为1.0×10¹~1.0×10⁴ PFU，免疫后3周攻击传染性支气管炎病毒LX4株。结果表明，在接种剂量为1.0×10²~ 1.0×10⁴ PFU的剂量范围内均可以使全部实验鸡产生局部反应，并对IBV的攻击形成保护，降低免疫鸡的发病率和死亡率，发病保护率达到73%以上；1.0×10¹ PFU接种实验鸡后，仅有5/11的鸡出现局部反应，对IBV攻击的发病保护率为64%，与对照组差异不显著（P>0.05）。以上结果说明，疫苗接种后的局部反应与重组疫苗的免疫效力之间具有相关性，根据疫苗生产使用实际情况确定传染性支气管炎重组鸡痘病毒疫苗的最适免疫剂量为10³PFU。

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采用AFLP和ERIC-PCR技术研究规模化鸡场健康鸡群中产气荚膜梭菌的遗传多样性

倪学勤;郑晓丽;曾东;Joshua Gong;宋振银;

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 717-724.

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为了调查产气荚膜梭菌在健康鸡群中的流行现状，掌握我国部分地区规模化鸡场产气荚膜梭菌的遗传多样性，分析其流行特点与地区差异的关系，利用AFLP（amplified fragment length polymorphism）和ERIC-PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR）方法对从四川省8个市10个规模化鸡场分离得到的34株A型产气荚膜梭菌进行基因型分析。结果表明，用AFLP技术将34株菌分为12个亚型，用ERIC-PCR方法分为8个亚型。分析亚型分布情况发现：不同鸡场产气荚膜梭菌的亚型差异明显；而同一鸡场的亚型较简单，以一种亚型为主，交叉有少数其他亚型；优势基因型分别为AFLP基因Ⅷ型或ERIC-PCR基因1型。该研究结果说明：四川省规模化鸡场健康鸡群中产气荚膜梭菌的遗传多样性较低，其流行特点与地区差异相关。

采用AFLP和ERIC-PCR技术研究规模化鸡场健康鸡群中产气荚膜梭菌的遗传多样性

倪学勤;郑晓丽;曾东;Joshua Gong;宋振银;

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 717-724. doi:

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鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达及生物学活性分析

谭兵;王红宁;张毅;张安云;樊汶樵

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 725-729.

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通过PCR方法扩增不含信号肽的鸡GM-CSF成熟蛋白基因，克隆至原核表达载体pET-32a（+），构建原核表达质粒p32GM-CSF，通过IPTG诱导重组鸡GM-CSF蛋白表达，经镍离子亲和层析纯化后，用MTT法检测表达重组蛋白的生物学活性，并制备兔抗鸡GM-CSF多克隆抗体。结果表明成功地构建了p32GM-CSF原核表达质粒, SDS-PAGE 结果显示表达的重组蛋白约34 ku,主要以包涵体形式表达，纯化后得到高纯度目的蛋白。Western Blot结果表明，该重组蛋白能与制备的抗鸡GM-CSF抗体特异性结合。MTT试验证实, 该重组蛋白具有明显增强鸡骨髓细胞增殖的生物学活性；这些研究结果表明，表达的重组chGM-CSF蛋白及其多克隆抗体拥有相应的生物学功能，这将为进一步研究鸡GM-CSF蛋白的生物学功能及其应用奠定基础。

鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达及生物学活性分析

谭兵;王红宁;张毅;张安云;樊汶樵

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 725-729. doi:

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鸡致病性大肠杆菌fimC基因缺失菌株的构建及生物学特性鉴定

孙庆杰;刘雪威;李一经

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 730-737.

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本研究目的是研究fimC基因的功能。基于致病性大肠杆菌(APEC)Ⅰ型菌毛fimC基因的已知序列，通过PCR扩增了缺失169 bp的fimC基因片段，将其克隆到自杀载体pCVD442中，通过接合性转导将重组自杀性质粒pCVD442∷△fimC从大肠杆菌SM10λpir转到O₂(NalR)中。根据同源重组原理构建了fimC基因缺失突变菌株O₂(△fimC)。结合PCR扩增、测序结果及透射电镜观察，证明正确构建了fimC基因缺失突变株O₂(△fimC)。体外生长及生化反应试验中，O₂(△fimC)与亲本株存在一定差异。药敏试验中，两者无明显区别。鸡气管黏膜黏附试验及雏鸡的致病性试验表明：突变株在鸡气管黏膜上的黏附能力是亲本株的1/50,对雏鸡的致病性亦明显下降。鸡致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimC基因缺失突变株的构建为深入探讨fimC基因在鸡大肠杆菌致病过程中所起的作用、Ⅰ型菌毛与机体相互作用的分子机制及fimC基因缺失突变株其他生物学特性的研究奠定了物质基础。

鸡致病性大肠杆菌fimC基因缺失菌株的构建及生物学特性鉴定

孙庆杰;刘雪威;李一经

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 730-737. doi:

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鸡致病性大肠杆菌菌毛fimC基因的表达及重组fimC蛋白卵黄抗体的免疫保护效力

王亚君;李一经

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 738-742.

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在表达鸡致病性大肠杆菌菌毛fimC基因的基础上，对fimC蛋白卵黄抗体的免疫保护效力进行测定。对鸡致病性大肠杆菌O2血清型菌株fimC基因序列进行扩增，扩增产物克隆至pMD18-T载体并测序。测序结果显示，fimC基因全长657 bp，编码218个氨基酸，与人源大肠杆菌fimC基因进行同源性比较，核苷酸序列同源性达97.9%，氨基酸序同源性为96%。从重组质粒pMD18-T-fimC上将fimC基因亚克隆到表达载体质粒pET-30c上，转化大肠杆菌BL21（DE3），表达出预期的25 ku融合蛋白，采用Western Blot对表达产物进行反应原性分析，结果显示fimC融合蛋白具有较好的抗原反应特异性。用表达的fimC蛋白免疫产蛋母鸡，制备fimC高免卵黄抗体。用制备的fimC高免卵黄抗体免疫1日龄健康雏鸡，1 d后注射鸡致病性大肠杆菌进行攻毒，结果显示，fimC卵黄抗体免疫组死亡率为40%，对照组分别为60%、70%，证明所制备的fimC蛋白卵黄抗体能在一定程度上抵抗鸡致病性大肠杆菌的攻击。

鸡致病性大肠杆菌菌毛fimC基因的表达及重组fimC蛋白卵黄抗体的免疫保护效力

王亚君;李一经

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 738-742. doi:

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奶牛乳腺上皮细胞系的建立

陈建晖;佟慧丽;李庆章;高学军

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 743-747.

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采用组织块种植法，成功地培养了奶牛乳腺上皮细胞，并利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状的检测，建立并鉴定了正常培养的奶牛乳腺上皮细胞系，细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力。通过对细胞传代及反复冻存，建立了奶牛乳腺上皮细胞系，获得了大量的乳腺上皮细胞。

奶牛乳腺上皮细胞系的建立

陈建晖;佟慧丽;李庆章;高学军

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 743-747. doi:

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不同年龄高原牦牛肺脏的组织结构特征

何俊峰;余四九;崔燕

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 748-755.

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为了研究牦牛肺脏对高原低氧的适应性过程的结构基础，通过多种组织化学方法和透射电镜技术对1日龄、5月龄和成年牦牛肺脏显微结构和超微结构进行研究。研究发现：1日龄、5月龄和成年组牦牛肺动脉中膜肌层所占管径的比例（MT%）均较高，分别为10.71%、12.53%和11.18%；1日龄牦牛细支气管管壁已形成一层完整的平滑肌层。牦牛呼吸道杯状细胞的分泌颗粒电子密度高，在颗粒中心有低电子密度的区域；Clara细胞的分泌物是有膜包裹的致密分泌颗粒、少量致密分泌颗粒和灰白色物质混合的分泌滴。1日龄、5月龄牦牛肺动脉受低氧的影响较大，内皮细胞增殖明显，呈立方状，突入管腔呈栅状排列；平滑肌细胞肥大呈立方状、细胞器显著增多；各年龄组牦牛血－气屏障厚度均很薄，与低海拔地区大鼠接近，1日龄、5月龄和成年组厚度分别为0.445、0.506和0.423 μm。以上结果表明，低氧对肺动脉内皮细胞、平滑肌细胞和细支气管平滑肌有明显的影响，这种影响在5月龄牦牛表现最为显著，但随着年龄的增长，低氧对牦牛肺脏结构的影响逐渐减弱。这种结构与年龄相关的变化表明牦牛在生长发育过程中其肺脏逐渐适应了高原低氧的环境。

不同年龄高原牦牛肺脏的组织结构特征

何俊峰;余四九;崔燕

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 748-755. doi:

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褪黑素对内毒素血症山羊肝线粒体功能的影响

刘玉清;唐兆新;郭剑英;苏荣胜;刘静

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 756-762.

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为探讨褪黑素对内毒素血症山羊肝线粒体功能的影响，将48只山羊随机分为4组，生理盐水组（saline，SL组）、内毒素组（LPS组，1 mg·kg^-1）、褪黑素组（MT组，1 mg·kg^-1）和褪黑素保护组（MT+LPS组）。各组分别在处理后第3和第6小时各宰杀6只羊，取肝组织，提取肝线粒体和肝线粒体DNA（mtDNA），检测线粒体膜电位（MMP）、ATP酶（ATPase）活性及心磷脂（CL）和肝线粒体DNA氧化产物8羟基脱氧鸟嘌呤核苷（8-OH-dG）含量。结果显示，与生理盐水组相比，内毒素血症时山羊肝线粒体MMP显著下降，ATPase活性抑制，CL含量显著减少，8-OH-dG水平明显增加；而与内毒素组比，褪黑素保护组山羊肝线粒体MMP明显升高，ATPase活性恢复，CL含量明显增加，8-OH-dG水平显著降低。结果提示，褪黑素能减轻内毒素诱导的山羊肝线粒体损伤，保护肝线粒体功能。

褪黑素对内毒素血症山羊肝线粒体功能的影响

刘玉清;唐兆新;郭剑英;苏荣胜;刘静

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 756-762. doi:

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亚麻籽木脂素在大鼠体内的代谢研究

周炜;王国杰;韩正康

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 763-768.

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用对亚麻籽木脂素产生适应性反应的大鼠为单胃动物模型，借助反相高效液相色谱分析技术，通过2个试验对单胃动物胃肠道内植物木脂素向动物木脂素转化的主要场所，对木脂素类化合物的吸收代谢进程进行了研究。试验Ⅰ：以抗生素处理为对照，观察灌胃亚麻籽木脂素提取物后48 h内大鼠胃肠道食糜、粪便、血清中2种动物木脂素及亚麻籽木脂素含量的时间-浓度变化曲线。试验Ⅱ：经大鼠肝胆总管插管收集大鼠胆汁，观察胆汁中亚麻籽木脂素及2种动物木脂素浓度在灌胃后49 h内的动态变化。结果提示：抗生素可显著抑制动物木脂素的生成，推测动物木脂素主要的生成场所是微生物含量相对较多的结肠和盲肠，且动物木脂素的生成依赖于胃肠道微生物的存在。动物木脂素前体物质亚麻籽木脂素能被吸收进入血液，且浓度高于同时间点动物木脂素的含量。在大鼠体内，亚麻籽木脂素及其2种代谢产物均存在肝肠循环。

亚麻籽木脂素在大鼠体内的代谢研究

周炜;王国杰;韩正康

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 763-768. doi:

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鸡CDC25B-mRNA探针制备及其在鸡十二指肠黏膜的原位杂交反应

覃君慧;侯放亮;张晖;包慧君;周强;李梅英;初晓红;陈秋生

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 769-774.

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应用RT-PCR方法从鸡胚中扩增CDC25B基因片段，将其连接于pGM-T easy。分别利用pGM-T easy中T7和SP6启动子及其RNA聚合酶，以线性化的CDC25B/pGM-Teasy为模板转录合成正、反义DIG标记RNA探针。以合成的地高辛（DIG）标记的CDC25B-mRNA为探针,进一步应用原位杂交组织化学方法（in situ hybridization histochemistry，ISHH）探查CDC25B-mRNA在鸡十二指肠黏膜的分布。结果表明，成年鸡十二指肠肠腺上皮细胞中有丰富的CDC25B-mRNA的转录，其中CDC25B-mRNA探针杂交阳性细胞在肠腺基底部和小肠绒毛中部分别占上皮细胞总数的81.60%±9.63%和36.21%±8.81%。原位杂交阳性产物大部分分布于十二指肠肠腺上皮“干细胞部”和“增生部”细胞的胞质和胞核，肠腺基底部杂交信号由下至上逐渐减弱，至小肠绒毛下部消失，转为阴性。在黏膜肌层以及肌肉层杂交反应呈阴性。本研究从基因水平证明了鸡十二指肠黏膜肠腺上皮“干细胞部”和“增生部”细胞中有CDC25B-mRNA的存在，表明该区域有活跃的增殖过程，以补充绒毛上端死亡脱落的细胞。

鸡CDC25B-mRNA探针制备及其在鸡十二指肠黏膜的原位杂交反应

覃君慧;侯放亮;张晖;包慧君;周强;李梅英;初晓红;陈秋生

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 769-774. doi:

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斯氏副柔线虫rDNA-ITS片段的克隆及序列分析

张晓东;杨晓野;杨莲茹;李林川;左海涛;娜仁花;赵治国;王俊杰

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 775-779.

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运用PCR方法以保守引物NC5、NC13、NC13r和NC2扩增从内蒙古地区骆驼皱胃分离的3条斯氏副柔线虫（Parabronema skrjabini）rDNA的内转录间隔区1（ITS1）、5.8S序列和内转录间隔区2（ITS2）。将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGMT载体，用PCR技术及酶切鉴定阳性菌落，对阳性菌落质粒DNA进行测序。结果表明线虫1（P.sk1）扩增的ITS片段大小为837 bp，包含部分的18S、28S及全部的ITS1（298 bp）、5.8S(157 bp)及ITS2（281 bp）序列；线虫2（P.sk2）扩增的ITS1片段大小为372 bp,包含部分的18S、5.8S及全部的ITS1（296 bp）；线虫3（P.sk3）扩增的ITS2片段大小为484 bp，包含部分的5.8S、28S及全部的ITS2（284 bp）序列。同其它属线虫同源性比较ITS2序列同源性在30.2%~60.1%。本研究系首次报道骆驼斯氏副柔线虫的ITS序列，为斯氏副柔线虫分子生物学的进一步研究奠定基础。

斯氏副柔线虫rDNA-ITS片段的克隆及序列分析

张晓东;杨晓野;杨莲茹;李林川;左海涛;娜仁花;赵治国;王俊杰

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 775-779. doi:

摘要 ( 1377 )

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内蒙古地方品种绵羊朊蛋白基因多态性分析

王伊琴;秦贞奎;包勇敢;寇福军;荆文奎;乔俊文;赵德明

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 780-784.

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对中国内蒙古的乌珠穆沁羊（46）、苏尼特羊（34）和蒙古羊（22）进行朊蛋白基因的克隆和多态性分析。结果表明，发现了8个朊蛋白基因多态性位点，其中M157I、Q220H、R223K为未见报道的朊蛋白基因多态性位点；痒病中度易感的朊蛋白基因ARQ/ARQ占74.5%，具有痒病抗性朊蛋白基因ARR/ARR占7.9%，未检出对痒病高度易感的朊蛋白基因VRQ/VRQ。从基因水平上推论，乌珠穆沁羊携带的羊痒病抗性的ARR/ARR基因频率较高（15.2%），占ARR/ARR基因型的87.5%，发生羊痒病风险较低。该研究结果在中国活羊的出口贸易和品种选育方面有重要的意义，为出入境动物检疫中羊痒病的风险分析和风险评估提供重要的基础理论资料。

内蒙古地方品种绵羊朊蛋白基因多态性分析

王伊琴;秦贞奎;包勇敢;寇福军;荆文奎;乔俊文;赵德明

畜牧兽医学报. 2009, 40(5): 780-784. doi:

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中国标准连	ISSN 0366-6964
续出版物号	CN 11-1985/S

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