GP5Δ84-119稳定表达对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.014

畜牧兽医学报 ›› 2016, Vol. 47 ›› Issue (2): 315-324.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.014

GP5^Δ84-119稳定表达对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

王晓红^1，2，宋林林^1，2，李亮亮^1，2，袁传奇^1，2，姜博^1，2，周恩民^1，2*，穆杨^1，2*

（1.西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100；2.农业部兽用药物与兽医生物技术陕西省科学观测实验站，杨凌 712100）

收稿日期:2015-06-20 出版日期:2016-02-23 发布日期:2016-02-23
通讯作者: 周恩民，E-mail：zhouem@nwsuaf.edu.cn；穆杨，E-mail：muyang@nwsuaf.edu.cn
作者简介:王晓红（1988-），女，陕西宝鸡人，硕士生，主要从事重大动物疫病发病机制研究，Tel：029-87091117，E-mail：13152427862@163.com
基金资助:
国家自然科学基金青年项目（31201883）；中央高校基本科研业务费（2014YB010；2452015318）

The Effect of GP5^Δ84-119 Stable Expression on the Replication of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

WANG Xiao-hong^1，2，SONG Lin-lin^1，2，LI Liang-liang^1，2，YUAN Chuan-qi^1，2，JIANG Bo^1，2，ZHOU En-min^1，2* ，MU Yang^1，2*

(1.College of Veterinary Medicine，Northwest A&F University，Yangling 712100，China；2.Scientific Observing and Experimental Station of Veterinary Pharmacology and Veterinary Biotechnology，Ministry of Agriculture，Yangling 712100，China)

Received:2015-06-20 Online:2016-02-23 Published:2016-02-23

摘要/Abstract

摘要：

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构蛋白GP5的第二胞外区在病毒复制中的作用及机制，利用PiggyBac Transposon System Vectors构建了表达删除84—119氨基酸残基的截短型GP5的重组质粒（pPB-GP5^Δ84-119），转染Marc-145细胞通过嘌呤霉素抗性筛选和3次亚克隆，筛选稳定表达GP5^Δ84-119的Marc-145细胞系，并利用cck-8试剂盒检测细胞的增殖情况；用PRRSV SD16株感染筛选的细胞，通过病毒基因拷贝数和病毒滴度检测GP5^Δ84-119表达对PRRSV复制影响；通过Real-time PCR和ELISA检测病毒感染前后细胞IFN-α、IFN-β、IFN-γ的表达情况。经RT-PCR、Western blot和IFA检测，GP5^Δ84-119在Marc-145细胞中获得稳定表达，将此细胞命名为Marc-145-GP5^Δ84-119；细胞增殖曲线显示GP5^Δ84-119的表达不影响细胞的增殖；对病毒基因拷贝数和病毒滴度检测发现GP5^Δ84-119的表达可以抑制PRRSV的复制，这种抑制作用可能是通过上调IFN特别是IFN-β的表达而实现的。研究表明GP5第二胞外区在PRRSV复制中发挥重要作用。

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒, GP5^&Delta, 84-119, 稳定表达, 复制, 干扰素

Abstract:

This experiment was conducted to study the role of the second extracellular domain of glycoprotein 5，one major structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)，on PRRSV replication and approach to its mechanism in Marc-145 cells.A recombinant plasmid (named as pPB-^GP5Δ84-119) expressing truncated GP5 was constructed using PiggyBac Transposon System Vectors and transfected to Marc-145 cells.Marc-145 cell line stably expressing GP5^Δ84-119 was obtained by puromycin resistance screening and triple subcloning and the selected cells proliferation was detected using cck-8 kit.The effect of GP5^Δ84-119 stable expression on PRRSV replication were determined thought detection of virus gene copy number in the infected cells and virus titers in the supernatant of infected cells.What’s more，the mRNA and protein expression levels of IFN-α，IFN-β，IFN-γ in the cells before and after PRRSV infection were also analyzed using Real-time PCR and ELISA.The results of RT-PCR，Western blot and IFA confirmed that GP5^Δ84-119 was stablely expressed in Marc-145 cells and the cells were named as Marc-145-GP5^Δ84-119.The result of cell proliferation assay confirmed that the expression of GP5^Δ84-119 did not affect the proliferation of Marc-145 cells.It was found that GP5^Δ84-119 expression inhibited the replication of highly pathogenic PRRSV in Marc-145 cells through upregulating IFN level，especially IFN-β.These findings suggest that the second extracellular domain of GP5 plays an important role in PRRSV replication.

Key words: porcine reproductive and respiratory syndrome virus, GP5^Δ84-119, stable expression；replication, interferon

中图分类号:

S852.659.6

王晓红，宋林林，李亮亮，袁传奇，姜博，周恩民，穆杨. GP5^Δ84-119稳定表达对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(2): 315-324.

WANG Xiao-hong，SONG Lin-lin，LI Liang-liang，YUAN Chuan-qi，JIANG Bo，ZHOU En-min，MU Yang. The Effect of GP5^Δ84-119 Stable Expression on the Replication of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2016, 47(2): 315-324.

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