猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子载体的构建及外源基因表达分析

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.014

畜牧兽医学报 ›› 2015, Vol. 46 ›› Issue (1): 111-118.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.014

猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子载体的构建及外源基因表达分析

王晓杜¹，赵凡凡^1,2，代兵¹，邵东华²，蒋春英²，周圻 ^1*，马志永^2*

(1.浙江农林大学动物科技学院，临安 300311；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

收稿日期:2014-05-05 出版日期:2015-01-23 发布日期:2015-02-02
通讯作者: 周圻， E-mail：azhouqi@aliyun.com；马志永， E-mail：zhiyongma@shvri.ac.cn
作者简介:王晓杜（1973-），男，湖北红安人，副教授，博士，主要从事人畜共患病病毒分子生物学研究，Tel：0571-61083275，E-mail：xiaoduwang@163.com
基金资助:
浙江省自然科学基金(Y3110124)；浙江省十二五重点学科动物营养与饲料科学；浙江农林大学发展基金（2013FR077）

Construction of DNA Replicon Vector of Swine Japanese Encephalitis Virus and Application of Exogenous Gene Expression Analysis

WANG Xiao-du¹，ZHAO Fan-fan^1,2，DAI Bing¹，SHAO Dong-hua²，JIANG Chun-ying²，ZHOU Qi^1*，MA Zhi-yong^2*

(1.College of Animal Science and Technology，Zhejiang A&F University，Lin’an 300311，China；2.Shanghai Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 200241，China)

Received:2014-05-05 Online:2015-01-23 Published:2015-02-02

摘要/Abstract

摘要：

猪日本乙型脑炎病毒(JEV)是引起以母猪流产为主要特征的繁殖障碍性疾病病原之一,笔者拟构建JEV的DNA型复制子载体,并利用该载体表达外源基因。以JEV毒株SA14-14-2为基础，去除病毒结构蛋白基因prM和部分E基因而保留全部非结构蛋白和非编码区序列，插入FMDV2A和丁肝病毒核酶序列构建复制子表达载体pAC-JEV，实时定量 PCR、间接免疫荧光、Western blotting方法检测JEV自身蛋白（NS3）表达，验证复制子的自主复制能力。在pAC-JEV的结构蛋白C基因下游插入EGFP基因、猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的GP5基因构建重组复制子pAC-JEV-EGFP、pAC-JEV-HA、pAC-JEV-GP5和NS5基因缺失载体pAC-JEV-ΔNS5，该复制子载体转染BHK-21，荧光显微镜直接观察EGFP表达，Western blotting方法检测外源蛋白质（GFP、GP5、HA）表达情况。结果表明：随着转染时间延长，复制子转染细胞内NS3的表达逐渐增加，表明所构建的JEV复制子表达载体具有自主复制能力。EGFP mRNA转录水平和EGFP蛋白质荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加，并且荧光信号可持续8 d以上，携带猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5基因的复制子载体转染BHK-21细胞后，HA和GP5能有效表达，说明复制子具有表达外源蛋白质的能力。该复制子表达载体的成功构建,为深入研究JEV各蛋白质的功能、各蛋白质与细胞内蛋白质相互作用关系以及基于复制子载体的疫苗开发等提供了技术平台。

关键词: 乙型脑炎病毒, 复制子, 表达载体, HA, GP5

Abstract:

Swine Japanese encephalitis virus (JEV) is one of pathogens that causing sow abortion.In this experiment，the DNA replicon vector was constructed and exogenous gene was expressed.Based on the JEV SA14-14-2 sequences，viral structural protein encoding gene prM and parts of E gene sequences were removed by mutant PCR methods，which retained nonstructural protein genes and non-coding region sequences，subgenomic replicon pAC-JEV that inserted FMDV-2A and HDV ribozyme sequences was constructed.In order to identify its abilities of self-replication，expression of nonstructural protein (NS3) were detected by western blotting and indirect immunofluorescence assay.The results showed that NS3 protein level increased gradually with extension of transfection times.To explore JEV replicon ability about expressing foreign proteins，we inserted an enhanced green fluorescence protein (EGFP) gene，HA gene of swine influenza virus and GP5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into the multiple cloning site of pAC-JEV(pAC-JEV-EGFP，pAC-JEV-HA，pAC-JEV-GP5) and mutation of NS5 gene was deleted (pAC-JEV-ΔNS5).The plasmids were transfected into BHK-21 cell，EGFP mRNA level was significantly increased at 48，72，96 h in pAC-JEV-EGFP by real-time PCR，the EGFP fluorescence was directly detected by the fluorescence microscope at 12 h，and EGFP fluorescence signal lasted for 8 days.HA of swine influenza virus and GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus were detected using mouse anti-HA and GP5 antibodies by Western blotting.The results show that HA and GP5 can be expressed in BHK-21 cells.This JEV subgenomic replicon pAC-JEV can be used to study JEV gene function and viral protein interaction with cellular proteins；it also is a valuable tool for DNA vaccine research.

Key words: JEV, replicon, expression vector, HA, GP5

中图分类号:

S852.659.6

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猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子载体的构建及外源基因表达分析

Construction of DNA Replicon Vector of Swine Japanese Encephalitis Virus and Application of Exogenous Gene Expression Analysis

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