猪流行性腹泻病毒COE基因在毕赤酵母中的表达及生物活性分析

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2014.08.020

畜牧兽医学报 ›› 2014, Vol. 45 ›› Issue (8): 1342-1347.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2014.08.020

猪流行性腹泻病毒COE基因在毕赤酵母中的表达及生物活性分析

胡青松¹，李吕木^1*，张小飞²，许发芝¹，丁小玲¹，徐延伟²，丁维民³

(1.安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036；2.南京天邦生物科技有限公司，南京 211102；3.安徽安泰农业集团，广德 242200)

收稿日期:2014-01-22 出版日期:2014-08-23 发布日期:2014-08-22
通讯作者: 李吕木（1956-），男，安徽和县人，研究员，博士，博士生导师，主要从事动物营养与饲料科学研究，E-mail：llm56@ahau.edu.cn
作者简介:胡青松（1987-），男，江苏沛县人，硕士生，主要从事猪饲料与营养研究，E-mail:963293490@qq.com
基金资助:
安徽省生猪产业技术体系（2012）

Expression of Porcine Epidemic Diarrhea Virus COE Gene in Pichia pastoris and Bioactivity Analysis of the Recombinant Protein

HU Qing-song¹，LI Lyu-mu^1*，ZHANG Xiao-fei²，XU Fa-zhi¹，DING Xiao-ling¹，XU Yan-wei²，DING Wei-min³

(1.College of Animal Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China；2.Nanjing Tianbang Bio-Industry CO.，LTD，Nanjing 211102，China；3.Anhui Antai Agricultural Group CO.，LTD，Guangde 242200，China)

Received:2014-01-22 Online:2014-08-23 Published:2014-08-22

摘要/Abstract

摘要：

旨在利用毕赤酵母表达系统表达猪流行性腹泻病毒（PEDV）COE蛋白，及研究COE蛋白免疫小鼠后产生抗体的中和病毒的能力。根据PEDV S糖蛋白基因设计引物，取患猪流行性腹泻病（PED）的仔猪肠道组织，抽提PEDV的总mRNA，进行RT-PCR扩增，获得PEDV部分保护性抗原基因（COE基因）片段。进一步将COE基因导入毕赤酵母表达载体，构建毕赤酵母表达质粒pPIC9K-COE重组质粒，并电转化入酵母感受态细胞GS115中，筛选高拷贝阳性重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白及其免疫原性，病毒中和试验评价重组蛋白免疫小鼠后血清抗体的病毒中和能力。RT-PCR扩增获得大小为530 bp的PEDV COE基因，该基因在毕赤酵母表达载体中能够正确表达，SDS-PAGE结果显示毕赤酵母表达的COE蛋白大小在27 ku左右，分泌表达量约30 mg•L^－1。Western blot表明PEDV COE重组蛋白具有反应原性。中和试验结果表明，PEDV COE重组蛋白免疫小鼠后血清中特异性抗体具有中和活性，中和效价为1∶36，而对照则小于1∶2。PEDV COE基因可在毕赤酵母中获得分泌表达，且表达的蛋白具有很好的生物学活性。

关键词: 猪流行性腹泻病毒, COE基因, 毕赤酵母表达, 中和活性

Abstract:

The aim of this study was to express the COE protein of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Pichia pastoris，and evaluate the neutralizing ability of mices serum after immunization with COE protein.A pair of primers was designed to clone PEDV COE gene，and the PEDV strain was isolated from a clinical sample.The PEDV COE ORF was amplified by RT-PCR.Then the PEDV COE gene was inserted into pPIC9K，and acquared the recombinant plasmid，pPIC9K-COE.After the pPIC9K-COE was linearized by SacⅠand transformed into P.pastoris GS115 by electroporation，the high copy positive recombinant bacteria were screened for inducible expression，which was induced by addition of methanol.SDS-PAGE and Western blot were conducted to analyze the recombinant protein and its immunogenicity.The neutralizing ability of mice serum after immuned with the recombinant PEDV COE was analyzed by virus neutralization test.An 530 bp gene, PEDV COE was amplified by RT-PCR，and the PEDV COE protein were expressed in P.pastoris.The result of SDS-PAGE showed that the 27 kDa PEDV COE protein was expressed in P.pastoris GS115，and the concentration was 30 mg•L^－1.Western blot analysis of the PEDV COE protein proved that the immunogenicity of the recombinant protein.And the virus neutralization test result showed that the sera from mice immunized with the recombinant protein possess neutralizing activity，and the neutralization titer was 1:36，while the control was less than 1:2.The results presented here demonstrate that PEDV COE protein can be correctly expressed in P.pastoris，and it has better biological activity.

Key words: porcine epidemic diarrhea virus, COE gene, Pichia pastoris expression, neutralizing activity

中图分类号:

S852.659.6

胡青松，李吕木，张小飞，许发芝，丁小玲，徐延伟，丁维民. 猪流行性腹泻病毒COE基因在毕赤酵母中的表达及生物活性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(8): 1342-1347.

HU Qing-song，LI Lyu-mu，ZHANG Xiao-fei，XU Fa-zhi，DING Xiao-ling，XU Yan-wei，DING Wei-min. Expression of Porcine Epidemic Diarrhea Virus COE Gene in Pichia pastoris and Bioactivity Analysis of the Recombinant Protein[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2014, 45(8): 1342-1347.

参考文献

［1］斯特劳 B E，阿莱尔 S D，蒙加林 W I，等.猪病学［M］.8版.赵德明，张仲秋，沈建忠，译.北京：中国农业大学出版社，2000:181-187.
［2］OLDHAM J.Letter to the editor［J］.Pig Farming,1972,10:72-73.
［3］SUN D B，FENG L，SHI H Y，et al.Identification of two novel B cell epitopes on porcine epidemic diarrhea virus spike protein［J］.Vet Microbiol，2008,131(1-2):73-81.
［4］KANG T J，SEO J E，KIM D H，et al.Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression od its neutralizing epitope in plants protein［J］.Protein Expr Purif，2005，41(2):378-383.
［5］CHANG S H，BAE J L，KANG T J，et al.Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus［J］.Mol Cells，2002，14(2):295-299.
［6］BAE J L，LEE J G，KANG T J，et al.Induction of antigen specific systemic and mucosal immune reponses by feeding antimals tranagenic plants expressing the antigen［J］.Vaccine，2003，21(25-26):4052-4058.
［7］董丽娜，高凤山，许崇波，等.表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定［J］.畜牧兽医学报，2008，39(12)：1743-1747.
［8］葛俊伟，姜艳平，汪淼，等.猪流行性腹泻病毒S1蛋白在干酪乳杆菌中的分泌表达及免疫原性分析［J］.中国预防兽医学报，2009，31(4):256-260.
［9］张强敏，郭福生，尹燕博，等.猪流行性腹泻病毒分子生物学特征［J］.中国病毒学，2002,17(4):381-384.
［10］孙东波，冯力，陈建飞，等.猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株S基因的克隆、序列分析及线性抗原表位区的鉴定［J］.病毒学报，2007，23(3):224-229.
［11］张百灵，陈建飞，邢雅玲，等.猪流行性腹泻病毒 (PEDV)与抗病毒天然免疫［J］.中国生物化学与分子生物学报，2011，27(6)：516-523.
［12］DUARTE M，LAUDE H.Sequence of the spike protein of the porcine epidemic diarrhoea virus［J］.J Gen Virol，1994，75(Pt5)：1195-1200.
［13］BAQUILOD G S V.Analysis for nucleotide sequence of the membrane protein gene of porcine epidemic diarrhea virus Chinju99［J］.Krn J Vet Res，2006，46(4)：355-361.
［14］MACAULEY-PATRICK S，FAZENDA M L，MCNEIL B，et al.Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system ［J］.Yeast，2005，22(4):249-270.
［15］CREGG J M，CEREGHINO J L，SHI J，et al.Recombinant protein expression in Pichia pastoris［J］.Mol Biotechnol，2000，16(1):23-52.
［16］罗竞红，游自立.巴斯德毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展［J］.生物技术通报，2007(3):75-79.
［17］陈国华，贾怀杰，曾爽，等.猪IL-2基因在毕赤酵母中的高效表达及生物活性分析［J］.畜牧兽医学报，2011，42(4):551-556.
［18］徐延伟.禽呼肠孤病毒σC蛋白在毕赤酵母中的表达及免疫保护性研究［D］.北京：中国农业科学院，2012.
［19］葛丽，李震，于瑞嵩，等.猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达［J］.中国兽医学报，2005，25(3):289-292.
［20］KIM Y S，KANG T J，JANG Y S，et al.Expression of neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus in potato plants［J］.Plant Cell Tiss Org，2005，82(2)：125-130.

[1]	沈小娟, 李晶娇, 边疆, 赵婷婷, 华修国, 崔立. 腹泻仔猪肠道病毒组学分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(3): 611-619.
[2]	沈小娟, 李晶娇, 边疆, 赵婷婷, 华修国, 崔立. 腹泻仔猪肠道病毒组学分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(3): 611-619.
[3]	梁文花, 贾云慧, 许程志, 吴运谱, 陈艳, 杨焕良, 乔传玲, 陈化兰. 两株H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白中和性单克隆抗体的制备及抗病毒活性研究[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(7): 1460-1466.
[4]	梁文花, 贾云慧, 许程志, 吴运谱, 陈艳, 杨焕良, 乔传玲, 陈化兰. 两株H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白中和性单克隆抗体的制备及抗病毒活性研究[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(7): 1460-1466.
[5]	王隆柏, 王晨燕, 吴学敏, 陈秋勇, 车勇良, 陈如敬, 周伦江. 变异猪流行性腹泻病毒M和N融合双基因的原核表达及表达产物免疫原性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(6): 1249-1255.
[6]	王隆柏, 王晨燕, 吴学敏, 陈秋勇, 车勇良, 陈如敬, 周伦江. 变异猪流行性腹泻病毒M和N融合双基因的原核表达及表达产物免疫原性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(6): 1249-1255.
[7]	董建国, 王瑞, 曲哲会, 赵瑜, 刘涛. 2014—2015年豫南地区猪流行性腹泻病毒S基因变异分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(4): 859-864.
[8]	罗尚星, 范京惠, 刘宝京, 师乾凯, 侯林杉, 左玉柱. 猪丁型冠状病毒与猪流行性腹泻病毒双重实时荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(4): 852-858.
[9]	罗尚星, 范京惠, 刘宝京, 师乾凯, 侯林杉, 左玉柱. 猪丁型冠状病毒与猪流行性腹泻病毒双重实时荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(4): 852-858.
[10]	董建国, 王瑞, 曲哲会, 赵瑜, 刘涛. 2014—2015年豫南地区猪流行性腹泻病毒S基因变异分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(4): 859-864.
[11]	张若曦, 张志, 顾文源, 刘天驹, 李翀, 王建昌, 李彬, 袁万哲, 王玉清, 韩庆安. 河北省猪腹泻相关病毒的检测及猪流行性腹泻病毒S基因遗传变异分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(3): 597-605.
[12]	张若曦, 张志, 顾文源, 刘天驹, 李翀, 王建昌, 李彬, 袁万哲, 王玉清, 韩庆安. 河北省猪腹泻相关病毒的检测及猪流行性腹泻病毒S基因遗传变异分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(3): 597-605.
[13]	姚作俊, 郝达仁, 白云, 颜国华, 王海敏, 宋勤叶, 李潭清. 检测猪流行性腹泻病毒S1蛋白抗体的间接ELISA方法[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(6): 1085-1091.
[14]	姚作俊, 郝达仁, 白云, 颜国华, 王海敏, 宋勤叶, 李潭清. 检测猪流行性腹泻病毒S1蛋白抗体的间接ELISA方法[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(6): 1085-1091.
[15]	李红杰，王晓雪，高冬生，黄慧敏，陈陆，常洪涛，王川庆，李永涛，赵军. 猪流行性腹泻病毒Nsp7的亚细胞定位和对Ⅰ型干扰素应答的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(3): 501-507.

猪流行性腹泻病毒COE基因在毕赤酵母中的表达及生物活性分析

Expression of Porcine Epidemic Diarrhea Virus COE Gene in Pichia pastoris and Bioactivity Analysis of the Recombinant Protein

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价