牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵袭蛋白4E的原核表达、纯化及其圆二色谱分析

畜牧兽医学报 ›› 2007, Vol. 38 ›› Issue (1): 84-88.

牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵袭蛋白4E的原核表达、纯化及其圆二色谱分析

徐广贤;赵德明;周向梅;尹晓敏;杨建民

中国农业大学动物医学院国家动物传染性海绵状脑病实验室, 北京 100094

收稿日期:1900-01-01 修回日期:1900-01-01 出版日期:2007-01-25 发布日期:2007-01-25

Prokaryotic Expression and Purification of Mammalian Cellentry Proteins 4 E (mce4 E) of Mycobacterium bovis and Analysis of Circular Dichroism Spectrum

National Animal TSE Laboratory, College of Veterinary Medicine, China Agricultural University

Received:1900-01-01 Revised:1900-01-01 Online:2007-01-25 Published:2007-01-25

摘要/Abstract

摘要： 为了阐明牛分枝杆菌侵入宿主细胞和在肺泡巨噬细胞长期存活的机理，本研究以牛分枝杆菌的DNA为模板，通过PCR的方法扩增克隆牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵袭蛋白4E（Mammalian cell-entry protein 4E，mce4 E）基因,将所扩增基因克隆于原核表达载体pET30a(+)并进行测序,结果显示该基因与GenBank上所公布的牛分枝杆菌和人分枝杆菌mce4 E基因同源性为100%。将重组表达载体转入宿主菌BL21进行诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE分析和Western-blotting免疫印迹鉴定,结果证明目的蛋白获得高效表达, 表达量占菌体总量的53.3%，分子量约为45 ku；利用Ni-NTA琼脂糖柱对表达蛋白进行纯化，纯化率大于95%；纯化的蛋白经过透析复性、圆二色谱(CD)测定，结果表明重组蛋白为典型的α螺旋型结构，经Jascow32软件分析计算，mce4E蛋白含有39.1%的α螺旋，60.9%的无规卷曲，无β-折叠和转角，为进一步开展牛分枝杆菌致病机理的研究和寻找新的药物作用靶位点奠定了基础。

关键词: 牛分枝杆菌, 哺乳动物细胞侵入蛋白, 原核表达, 圆二色谱（CD）

Abstract: The genome DNA of Mycobacterium bovis(C68-2) was extracted by CTAB method.A pair of primers was designed and synthesized according to the sequences of mammalian cellentry proteins 4E(mce4 E) gene of M.bovis in GenBank. The PCR product was inserted into pGEM-T vector. Then the expression plasmid was constructed by inserting the target gene fragment into pET30a(+) vector. By transforming recombinant pET30a-mce4E into BL21,the mce4E protein of M.bovis was expressed in E.coli. The expressed truncated Histagged proteins accumulated in inclusion bodies. Purification was performed on a nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) agarose column, and renaturation was performed by dialysis. Final refolded protein was identified by SDSPAGE and western blotting assay. The protein conformation was analyzed by circular dichroism (CD) analysis. The content of secondary structure was αhelix (39.1%) and freedom curl (60.9%), without β-sheet and turn. Our research give some new insights into the pathology for mammalian, and provide good approach for further research for the target site of medicine action.

Key words: Mycobacterium bovis, mammalian cellentry proteins 4 E (mce4 E), porkaryotic expression, circular dichroism (CD)

徐广贤;赵德明;周向梅;尹晓敏;杨建民. 牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵袭蛋白4E的原核表达、纯化及其圆二色谱分析[J]. 畜牧兽医学报, 2007, 38(1): 84-88.

[1]	高俊莹, 张东超, 李璇, 王华琳, 姜宁. 弓形虫表面抗原SAG1黏附宿主细胞表面硫化肝素的特性研究[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(9): 1874-1881.
[2]	王俊伟, 陈芳洲, 库旭钢, 李畅, 何启盖. 基于PCV3-Cap蛋白间接ELISA检测方法的建立及临床应用[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(2): 454-460.
[3]	王俊伟, 陈芳洲, 库旭钢, 李畅, 何启盖. 基于PCV3-Cap蛋白间接ELISA检测方法的建立及临床应用[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(2): 454-460.
[4]	王艳芳, 周雅坪, 郭婷, 张新竹, 吴倩, 陈昕迪, 郝永清. 牛支原体EF-Tu基因的克隆表达、亚细胞定位及间接ELISA方法建立[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(1): 134-142.
[5]	王艳芳, 周雅坪, 郭婷, 张新竹, 吴倩, 陈昕迪, 郝永清. 牛支原体EF-Tu基因的克隆表达、亚细胞定位及间接ELISA方法建立[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(1): 134-142.
[6]	张媛媛, 许蓉, 何川川, 李肖纯, 程贵凤, 郭露, 刘金明, 李浩, 古少鹏, 金亚美. 日本血吸虫ELAV-like 2基因的克隆、表达及功能分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(9): 1987-1997.
[7]	张媛媛, 许蓉, 何川川, 李肖纯, 程贵凤, 郭露, 刘金明, 李浩, 古少鹏, 金亚美. 日本血吸虫ELAV-like 2基因的克隆、表达及功能分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(9): 1987-1997.
[8]	李成, 张雨迪, 黄小波, 刘浩宇, 刘志鹏, 赵玉佳, 曹三杰, 文心田, 文翼平, 赵勤, 伍锐. 猪丁型冠状病毒S1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(6): 1256-1264.
[9]	李成, 张雨迪, 黄小波, 刘浩宇, 刘志鹏, 赵玉佳, 曹三杰, 文心田, 文翼平, 赵勤, 伍锐. 猪丁型冠状病毒S1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(6): 1256-1264.
[10]	李志鹏, 刘福航, 崔奎青, 石德顺, 刘庆友. 铁蛋白Ferritin原核表达和纯化及纳米颗粒胞外自组装[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(1): 75-82.
[11]	李志鹏, 刘福航, 崔奎青, 石德顺, 刘庆友. 铁蛋白Ferritin原核表达和纯化及纳米颗粒胞外自组装[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(1): 75-82.
[12]	李强, 刘春法, 何小丽, 李凡飞, 魏凡华, 赵德明, 周向梅, 许立华. cGAS介导牛分枝杆菌诱导小鼠髓源树突状细胞成熟[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(5): 914-921.
[13]	李强, 刘春法, 何小丽, 李凡飞, 魏凡华, 赵德明, 周向梅, 许立华. cGAS介导牛分枝杆菌诱导小鼠髓源树突状细胞成熟[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(5): 914-921.
[14]	姚焱彬，陆萍，杨志鹏，魏建忠，孙裴，李郁. 猪丹毒丝菌SpaA基因原核表达及表达蛋白质的免疫原性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(3): 492-500.
[15]	王瑾，唐青海，谷雅静，李晓楠，李羽，王雪雨，姚伦广，阚云超. 猪ELF4基因的克隆、蛋白表达及其多克隆抗体制备[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(3): 425-435.