畜牧兽医学报 ›› 2009, Vol. 40 ›› Issue (7): 982-991.doi:
刘长青1,2,3,张洪海4,文杰2,马月辉2* ,关伟军2* ,唐学玺1
LIU Changqing ,ZHANG Honghai ,WEN Jie 2,MA Yuehui 2* ,GUAN Weijun 2* ,TANG Xuexi 1
摘要: 利用RTPCR与RACE方法检测寿光鸡心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌与胸肌8种组织腺苷酸琥珀酸裂解酶(ADSL)基因mRNA的差异表达水平,构建ADSL基因融合表达载体pGEXADSL,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性克隆,IPTG诱导表达,通过构建真核表达载体pEGFPADSL,利用脂质体介导法转染寿光鸡成纤维细胞,并进行阳性细胞的克隆化筛选与检测。结果表明:ADSL基因开放阅读框序列长为1 455 bp,编码485个氨基酸;5′端非转录调控区具有典型管家基因的特征,在邻近起始密码子-28 bp处发生C→T突变,该突变使该位点变为核呼吸因子2(NRF2)结合位点;经SDSPAGE电泳显示,pGEXADSL重组融合蛋白在分子量约为805 ku处有特异的蛋白条带出现,与预期分子量大小一致,等电点为679,纯化后用Westernblot检测为寿光鸡ADSL蛋白。pEGFPADSL转染寿光鸡成纤维靶细胞后24、48和72 h,转染率在264%~412%之间,绿色荧光均匀分布于细胞质与细胞核中,随表达量的增加,绿色荧光在细胞核中聚集成团块状或颗粒状,经药物筛选和克隆化培养,获得表达pEGFPADSL融合蛋白的阳性克隆细胞株,经RTPCR扩增与Westernblot检测确认ADSL融合蛋白基因已经整合到寿光鸡成纤维细胞的基因组中,获得正常表达。研究结果为揭示我国优良地方鸡种的风味基因结构,研究其生物学功能奠定基础。